1、 ICS 65.020.01 CCS B 05 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 32792023 苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法 Identification of fusarium acuminatum of alfalfa root rot 2023-12-29 发布2024-01-29 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 32792023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古自
2、治区农牧业技术推广中心、内蒙古自治区乡村振兴研究中心。本文件主要起草人：史志丹、孙红霞、丁海君、房永雨、杨永青、郭呈宇、伊风艳、燕梦娇、郭晨、孙林、刘思博、张英、刘亚东、李国强。DB15/T 32792023 1 苜蓿根腐病锐顶镰刀菌鉴定方法 1 范围 本文件规定了苜蓿锐顶镰刀菌根腐病鉴定的主要仪器与用具、主要试剂与材料、实验室检测、结果判定。本文件适用于苜蓿锐顶镰刀菌根腐病的室内鉴定。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。锐顶镰刀菌根腐病 fusarium acuminatum root rot 由锐顶镰刀菌（Fusarium acumin
3、atum）引起的苜蓿根腐病，在感染初期，苜蓿的根皮附近会出现褐色或暗褐色的坏死斑，根系毛根减少，部分叶子出现黄叶，发病严重时叶片枯黄，植株根部的中柱腐烂霉变，并发生坏死，根茎出现中空，侧根出现大量腐烂坏死，分枝减少。4 主要仪器与用具 光学显微镜、摇床、培养箱、超净工作台、高速冷冻离心机、PCR仪、培养皿、酒精灯、血球计数板、解剖刀、接种针、移液器、枪头、离心管。5 主要试剂与材料 试剂 5.1.1 次氯酸钠。5.1.2 无水乙醇。5.1.3 硫酸链霉素(500 mg/mL)。5.1.4 真菌基因组提取试剂盒。5.1.5 PCR SuperMix。5.1.6 凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，Lo
4、ading Buffer，DL2000 DNA Marker。培养基 5.2.1 水琼脂培养基（WA:Water Agar）：琼脂粉 15 g，加蒸馏水定容至 1000 mL，121 高压湿热DB15/T 32792023 2 灭菌 20 min。5.2.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA:Potato Dextrose Agar）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉 15 g，加蒸馏水定容至 1000 mL，121 高压灭菌 20 min。5.2.3 马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB:Potato Dextrose Broth）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，加蒸馏水定容至
5、1000 mL，121 高压灭菌 20 min。5.2.4 绿豆琼脂培养基（MBA:Mung Bean Agar）：绿豆粉 60 g，琼脂粉 15 g，加蒸馏水定容至 1000 mL，121 高压灭菌 20 min。6 实验室检测 病原菌的分离和纯化 6.1.1 病原菌的分离 从苜蓿田采集患有根腐病的典型病株。用水清洗样品表面的砂砾和土壤，从根部病健交界部位切成约0.5 cm0.5 cm的小组织块，用75%酒精和1%次氯酸钠分别处理3 min和5 min，无菌水清洗5次。把表面消毒的发病组织放在PDA培养基上25 培养，见附录A中的图A.1。6.1.2 病原菌的纯化 待PDA培养基长出菌落后取
6、菌落边缘的菌丝转接3次后再进行单孢分离获得纯化菌株用于后续试验，见附录A中的图A.1。用30%灭菌甘油将分离鉴定后的菌株于-80 保存，对不需长期保存的菌株及时灭活处理。感染苜蓿根腐病的样品保存于4 冰箱中，以备复核。菌落培养特性和病菌形态特征鉴定 6.2.1 锐顶镰刀菌在 PDA 培养基生长形态 锐顶镰刀菌在PDA平板上菌丝呈粉红色绒毛状，生长到后期，颜色逐渐加深变成桃红色，菌丝有隔且具分支，见附录A的图A.2。6.2.2 锐顶镰刀菌分生孢子 锐顶镰刀菌小型分生孢子数量较少，呈长椭圆形，01个分隔，大小为6.8 m14.0 m3.5 m4.9 m。大型分生孢子数量较多，弯刀型，中间较宽、较胖
7、，两端稍尖并稍弯曲，25个分隔，大小为18.2 m38.5 m3.9 m6.3 m，见附录A中的图A.3。分子鉴定 6.3.1 病原菌基因组 DNA 的提取 病原菌菌株在25 下PDA平板上生长57 d后，转接至装有50 mL的PDB培养基静置生长3 d，离心收集菌丝，液氮下研磨，使用真菌基因组提取试剂盒提取病原菌DNA后进行分子生物学鉴定。6.3.2 PCR 检测鉴定 6.3.2.1 引物 采用rDNA-ITS区通用引物ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3)和RPB2基因通用引物fRPB2-7Cf(5-ATG
8、GGYAARCAAGCYATGGG-3)和fRPB2-11aR(5-G DB15/T 32792023 3 CRTGGATCTTRTCRTCSACC-3）以及镰刀菌PHO序列引物Fusphoo-f(5-ATGCARGGYATYGGHCARC THGT-3)和Fusphoo-r(5-ACRTTRGTRGCATCCTTRGWRGART-3)进行PCR扩增。6.3.2.2 PCR 结果PCR获得ITS、RPB2、PHO序列大小分别为530 bp左右和850 bp左右，以及为500 bp左右的目的片段，见附录A中的图A.4。送至测序公司进行测序，测序结果在NCBI数据库比对。6.3.2.3 聚类分析
9、聚类分析结果表明，以ITS序列构建的系统发育树中，菌株与 NCBI数据库中的三线镰刀菌(JX989827.1)、燕麦镰刀菌（KX058547.1）、锐顶镰刀菌（MT557673.1）聚为同一类，见附录A中的图A.5。以fRPB2序列构建的系统发育树中，菌株与NCBI数据库中的锐顶镰刀菌(HM068335.1)聚为同一类，见附录A中的图A.6。以PHO序列构建的系统发育树中，菌株与NCBI数据库中的锐顶镰刀菌(KJ200247.1)聚于同一类，见附录A中的图A.7。致病性测定 6.4.1 分生孢子悬浮液制备 选取形态特征与F.acuminatum形态特征相符且PCR检测鉴定阳性的分离菌株，在绿豆
10、培养基上培养获得分生孢子，用无菌水配置成浓度为106个/mL分生孢子悬浮液。6.4.2 病原菌回接 消毒后的苜蓿种子播种于灭菌营养土中，播种40 d后，用分生孢子液接种的大米接种苜蓿根部。采用针刺法接种苜蓿根部，在伤口处接种10粒左右大米，期间要保持土壤湿润。在接种后14 d20 d。对接种发病的苜蓿根部再做病原菌分离、培养，观察是否与F.acuminatum的形态特征一致，并对分离菌进行PCR检测。7 结果判定 符合锐顶镰刀菌根腐病为害症状，菌落培养特性和病菌形态学特征与锐顶镰刀菌（F.acuminatum）相符，PCR 扩增鉴定为 F.acuminatum，且苜蓿致病性测试的分离物，鉴定定
11、为 F.acuminatum。DB15/T 32792023 4 A A 附录A （资料性）苜蓿根腐病锐顶镰刀菌的分离鉴定过程 苜蓿根腐病锐顶镰刀菌的分离鉴定过程见图A.1图A.7。图A.1 苜蓿根腐病病原菌的分离纯化 注：A:锐顶镰刀菌在PDA平板正面，B：锐顶镰刀菌在PDA平板背面。图A.2 PDA 培养基锐顶镰刀菌生长形态 取样清洗分离涂板提取测序比对镜检再次分离摇菌BADB15/T 32792023 5 注：A:小型分生孢子B:大型分生孢子C:菌丝。图A.3 锐顶镰刀菌孢子与菌丝形态 注：A:ITS引物PCR电泳图，M为DL2000 DNA，2泳道为CK,13-18泳道为检测菌株，B:RBP2引物PCR电泳图，M为DL2000 DNA，21泳道为CK,2-20泳道为检测菌株，C:PHO引物PCR电泳图，M为DL2000 DNA，2-3泳道为CK,4-11，13-22泳道为检测菌株。图A.4 PCR 电泳图 500bp250bpA750bp500bpCB1000b750bpACBDB15/T 32792023 6 图A.5 系统发育树ITS 序列 图A.6 系统发育树fPRB2 序列 图A.7 系统发育树PHO 序列
