1、 ICS 65.020.01 CCS B 20 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 32982024 苜蓿镰刀菌根腐病室内抗性鉴定技术规程 Code of practice for identification of alfalfa resistance to Fusarium Root Rot in room 2024-01-25 发布2024-02-25 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 32982024 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。本文件起草
2、单位：中国农业科学院草原研究所、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、内蒙古草业技术创新中心有限公司、巴彦淖尔市现代农牧事业发展中心、内蒙古自治区林业和草原监测规划院。本文件主要起草人：张园园、林克剑、贾瑞芳、陈正强、张晓萝、王乐、王圣泽、吴杰、肖皓文、韩兆敏、张枫青、杨文。DB15/T 32982024 1 苜蓿镰刀菌根腐病室内抗性鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了苜蓿抗镰刀菌根腐病的接种体制备、抗病性鉴定、病情调查和抗病性评价。本文件适用于室内评价苜蓿不同品种对镰刀菌根腐病的抗性水平。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅
3、该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 6141 豆科草种子质量分级 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。苜蓿镰刀菌根腐病 Alfalfa Fusarium Root Rot 由镰刀菌（Fusarium spp.）引起的土传性真菌病害，造成根和根颈部出现褐色病斑至腐烂凹陷，开裂或剥脱，中柱红褐色至暗褐色，植株萎蔫直至死亡。接种体 Inoculum 在实验室条件下培养的用于人工接种的病原菌繁殖体或营养体。4 接种体制备 供试菌种 选取内蒙古苜蓿种植区发病株上分离获得的具有中等致病力的根腐病优势菌株锐顶镰刀菌（Fusarium a
4、cuminatum）。培养基制备 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA 培养基）：马铃薯 200 g，洗净去皮切成 1 cm2 cm 的小块，加水煮沸 20 min，纱布过滤，加入葡萄糖 20 g 和琼脂 15 g，待完全熔化后，用水定容至 1000 mL，搅拌均匀，高压灭菌（121，20 min）。麦麸培养基：将 40 mL 蒸馏水加入 60 g 麦麸中拌匀，装入三角瓶中，高压灭菌（121，30 min）。DB15/T 32982024 2 接种体繁殖 在无菌条件下将接种菌株转接于PDA平板培养基上，25 恒温培养3 d5 d，自菌落边缘打取直径6 mm菌饼35块，接种于灭菌的麦麸培养基上，摇匀后
5、置于恒温培养箱25 培养7 d。接种悬浮液制备 用200 mL300 mL无菌水将麦麸进行淘洗，用四层纱布过滤，获得孢子悬浮母液，配制成孢子量为5106个/mL的悬浮液用于接种。5 抗病性鉴定 种子质量 鉴定品种的种子质量应符合GB 6141中苜蓿一级种标准。育苗 将种子在3%次氯酸钠溶液中浸泡2 min，转至75%乙醇溶液中消毒30 s，无菌水冲洗5遍，播种于装有灭菌营养土的穴盘中。置于温度24 26，空气相对湿度30%40%的温室条件下，待苜蓿幼苗生长至34片复叶时接种。接种 5.3.1 接种方法采用蘸根接种法进行接种（详见参考文献1）。将幼苗从穴盘中取出，根系冲洗干净后完全浸泡于接种悬浮
6、液中，30 min后将幼苗重新移植于装有灭菌营养土的营养钵（高10 cm，直径10 cm）中，每钵5株，每个处理30株，重复三次。5.3.2 接种后管理 将营养钵置于24 26，光照10 h12 h温室条件下生长，保持基质湿润。5.3.3 对照品种 选择高感苜蓿品种为对照材料。6 病情调查 病情级别划分 病情级别划分见表 1（引自参考文献 2）。表1 苜蓿镰刀菌根腐病抗性室内鉴定病情级别的划分 病情级别代表值症状描述10 健康无症状2 1 根颈部出现少量黑褐色、较小斑点3 2 根颈被黑褐病斑包围DB15/T 32982024 3 表1 苜蓿镰刀菌根腐病抗性室内鉴定病情级别的划分（续）病情级别代
7、表值症状描述4 3 根颈缢缩变黑，出现枯叶5 4 根颈大部分变黑变褐，大多数叶片干枯6 5 根颈部全部腐烂，整株枯死调查方法 接种35 d后，按病情级别调查并记录接种株发病情况，计算病情指数（DI）。病情指数按公式（1）计算：DI=（sn）NS100（1）式中：DI病情指数；S 各病情级别代表数值；n 各病情级别病株数；N 调查总株数；S 最高病情级别代表值。注：计算结果精确到小数点后两位。7 抗病性评价 抗病性评价标准 依据病情指数（DI）的平均值评价其抗性水平，划分标准见表 2（引自参考文献 3）。表2 苜蓿镰刀菌根腐病抗性评定标准 病情指数（DI）抗病类型 DI=0 免疫（Immune，
8、I）0DI20 高抗（High Resistant，HR）20DI40 中抗（Mid-Resistant，MR）40DI60 中感（Mid-Susceptible，MS）DI60 高感（High Susceptible，HS）有效性判别 对照高感品种病情指数大于60（DI60），该批次根腐病抗性鉴定视为有效。8 鉴定结果 根据本文件 6 和 7，将不同病情级别的株数、病情指数、3 个重复的平均病情指数、抗性评价等鉴定结果填入附录 A。DB15/T 32982024 4 A A 附录A （规范性）苜蓿镰刀菌根腐病抗性鉴定结果记载表 苜蓿镰刀菌根腐病抗性鉴定结果记载见表A.1。表A.1 苜蓿镰刀菌
9、根腐病抗性鉴定结果记载表 编号品种/名称送样单位重复病情级别病情指数平均病情指数抗性评价0 1 2 3 4 5 播种日期：接种日期：调查日期：鉴定技术负责人（签字）：DB15/T 32982024 5 参考文献 1 Subbarao K V,Hubbard J C,Greathead A S,et al.1997.Verticillium Wilt.Compendium of lettuce diseasesM.St Paul,MN:The American Phytopathological Society,1997:26-27.2 蔡文涌,王肖肖,方香玲.不同尖孢镰刀菌菌株对紫花苜蓿幼苗生长的影响J.草地学报,2020,28(05):1233-1239.3 潘龙其,张丽,田进山,等.紫花苜蓿不同品种对拟枝孢镰刀菌的抗性评价J.草业学报,2016,25(5):95-101.
