1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 32592023 羊肝细胞体外培养技术规程 The code of practice on cells of lamb hepatic in vitro culture 2023-12-15 发布2024-01-15 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 32592023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件
2、起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：孙海洲、桑丹、金鹿、刘秀梅、张春华、杨鼎、张崇志、李胜利、王博、萨初拉、刘威、宝华、胡晓晓、李文婷、付乐。DB15/T 32592023 1 羊肝细胞体外培养技术规程 1 范围 本文件规定了羊肝细胞体外培养技术规程的程序确立、工作区条件和方法。本文件适用于羊的肝细胞体外培养。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义
3、下列术语和定义适用于本文件。肝细胞体外培养 in vitro culture of hepatic cells 以羊肝脏组织为材料，经体外培养、分离出呈圆球形、分散状态细胞的过程。4 设施设备 工作区应包括准备室、缓冲间、无菌室及细胞保存室。无菌室应配备超净工作台、紫外灯、酒精灯、二氧化碳培养箱等相关设备。细胞保存室应配备冰箱、超低温冰箱和液氮罐等设备。5 方法 试剂与溶液配制 5.1.1 如无特别说明，所用试剂均为分析纯。5.1.2 本标准所用水，一律应符合 GB/T 6682 中三级水。5.1.3 磷酸氢二钠、氯化钠、盐酸、氯化钙、氯化钾、氢氧化钠、磷酸氢二钾、氢氧化钾、葡萄糖、乙二胺四乙
4、酸二钠、地塞米松、罗斯韦尔公园纪念研究所 1640 培养基（RPMI1640）、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、胎牛血清、胰岛素、青霉素、链霉素、型胶原酶及0.4%台盼蓝溶液。5.1.4 肝素钠：将 1 g 肝素钠溶解于 20 mL 水中，用 0.22 m 滤膜过滤除菌，分装并保存于-20 冰箱中备用。DB15/T 32592023 2 5.1.5 型胶原酶：准确称取 50 mg 的型胶原酶粉末溶解于 1 mL 的基础培养液中，用 0.22 m 滤膜过滤除菌，即可配制成 50 g/L 的型胶原酶，配置完成后立即使用。5.1.6 双抗：准确称取 1 g
5、 链霉素和 0.625 g 青霉素，充分溶解于 200 mL 的水中，用 0.22 m 滤膜过滤除菌，分装并保存于-20 冰箱中备用。5.1.7 胰岛素母液：50 mg 胰岛素溶解于 20 mL 浓度为 0.01 mmol/L 的盐酸溶液中，配制成 4.36 mol/L10-4mol/L 的胰岛素母液，用 0.22 m 滤膜过滤除菌，分装并保存于-80 冰箱中备用。5.1.8 Percoll 细胞分离液：取 27 mL Percoll 液，加入 3 mL PBS 液（10）混匀，再从混匀的液体中取 9 mL 加入 15 mL PBS（1），与离心后的肝细胞沉淀混合。5.1.9 灌流液 A：准确
6、称取 8.1816 g 氯化钠、0.4995 g 氯化钾、2.3831 g HEPES、0.4500 g 葡萄糖和 0.1861 g 乙二胺四乙酸二钠，溶于 800 mL 水中，加水定容至 1000 mL。用 1 mmol/L 盐酸或 l mmol/L氢氧化钠调整 pH 值为 7.2。在无菌超净工作台，按 1:100 mL 加入双抗，用 0.22 m 滤膜过滤除菌，4 保存备用，使用前 37 预热。5.1.10 灌流液 B：准确称取 8.1816 g 氯化钠、0.4995 g 氯化钾、6.8493 g HEPES、0.4500 g 葡萄糖和 0.5550 g 氯化钙，溶于 800 mL 水中，
7、加水定容至 1000 mL。用 0.22 m 滤膜过滤除菌，4 保存备用，使用前 37 预热。5.1.11 灌流液 C：在灌流液 B 的基础上，每 500 mL 灌流液 B 加入 2 mL 的 50 g/L 的 IV 胶原酶母液，使其含有 0.2 g/L 的 IV 胶原酶。用 0.22 m 滤膜过滤除菌，现配现用，使用前 37 预热。5.1.12 RPIM1640 基础培养液：将一袋 RPIM1640 粉末培养基于 1 L 超纯水中，加入 2.0 g 碳酸氢钠调节 pH 值，用 0.22 m 的过滤器过滤除菌，放 4C 冰箱冷藏备用。5.1.13 RPIM1640 贴壁培养液：在每 200 m
8、L RPIM1640 基础培养液中加入 20 mL 胎牛血清、10-6 mol/L的胰岛素 0.460 mL、10-6 mol/L 的地塞米松 16 L、双抗 2 mL，5 mg/mL 的维生素 C 8 L。用 0.22 m滤膜过滤除菌，分装封口，4 保存备用。5.1.14 RPIM 1640 生长培养液：在 RPIM1640 基础培养液中添加 5%的胎牛血清和 1%双抗。用 0.22 m滤膜过滤除菌，分装封口，4 保存备用。5.1.15 冻存液：将胎牛血清、DMSO 及 RPMI1640 培养液按 2:1:7 比例混合，用 0.22 m 滤膜过滤除菌，现配现用。培养方法 5.2.1 肝细胞分
9、离及培养 5.2.1.1 羊空腹 24 h 后侧卧保定，腹部剪毛消毒后静脉麻醉，静脉注射每千克体重 1500 IU 的肝素钠。剖开腹腔无菌取肝脏尾状突约 40 g，置于无菌器皿内迅速将其转入细胞间。5.2.1.2 清洗肝脏尾状突表面血迹，对切面进行修整使血管充分暴露，切面的血管数一般为 23 个。调整肝脏尾状突抓握方式，将灌流管一端插入其中的一个血管口，用手指将另外两个血管口堵严，以防灌注时灌流液滴洒，另一端灌注灌流液。5.2.1.3 灌注灌流液 A，灌注液流速约为 50 mL/min，持续 10 min15 min。5.2.1.4 灌注灌流液 B，灌注液流速约为 50 mL/min，随着灌流
10、液的注入，肝脏尾状突逐渐变得充盈，尾状突由中间至四周从暗红色变至棕白色，流出的灌流液由血色变澄清。5.2.1.5 灌注灌流液 C，灌注液流速约为 20 mL/min，尾状突逐渐变软，且流出的灌流液逐渐混浊。5.2.1.6 将尾状突移入无菌平皿中，加入 20 mL50 mL 胎牛血清，轻轻撕掉肝脏被膜，将血管、脂肪和结缔组织去除，剪去周边未被消化部分。5.2.1.7 收集被消化的肝脏乳糜组织，剪碎较大的肝组织，分别用 100 目(150 m)、200 目(75 m)及 500 目(30 m)细胞筛过滤消化后的肝组织。DB15/T 32592023 3 5.2.1.8 收集肝细胞悬液，用 500
11、r/min 冷冻离心机离心 5 min10 min，弃上清液用 RPMI1640 生长培养液清洗 23 次，用 RPMI1640 贴壁培养液重悬，0.4%台盼蓝检测细胞活率，血细胞计数板计数。5.2.1.9 用贴壁培养液将细胞悬液调整为 2.6 个/mL106个/mL 密度，接种于六孔培养板中每孔 2 mL，置于二氧化碳培养箱 37、5%CO2条件下培养。5.2.1.10 4 h 后换成生长培养液，以后每 2 d 更换一次培养液，并对肝细胞形态及生长情况进行跟踪记录。5.2.2 肝细胞纯化 5.2.2.1 将肝细胞悬液用 RPMI1640 生长培养液清洗 23 次，500 r/min 冷冻离心
12、机离心 5 min10 min，弃上清液。5.2.2.2 用 Percoll 细胞分离液重悬肝细胞，2000 r/min 冷冻离心机离心 10 min，收集中间层的细胞得到纯化的肝细胞。5.2.2.3 用 RPMI1640 生长培养液重悬，500 r/min 冷冻离心机离心 3 min，洗涤 2 次。最后以 RPMI1640生长培养液重悬肝细胞制成纯化的肝细胞悬液备用。5.2.3 肝细胞冻存 5.2.3.1 在细胞汇合前，将细胞同培养液一同吸出，放入 4 mL 离心管中。5.2.3.2 在培养皿中加入 1 mL 胰蛋白酶溶液进行消化，摇晃 45 次，使胰蛋白酶溶液与细胞充分接触。5.2.3.3
13、 1000 r/min 离心 5 min，吸出含酶的上清溶液。5.2.3.4 将细胞生长面洗脱，用 1.5 mL 培养液再次悬浮，1000 r/min 离心 5 min，再用 1 mL 冻存液重新悬浮细胞。5.2.3.5 加入适量冻存液，为冻存做准备。5.2.3.6 将 1 mL 冻存液悬浮的细胞移至 1.5 mL 离心管中，用脱脂棉将冻存管包好后放入样品袋中，管口朝上放入 4 冰箱 2 h 左右，取出放入-20 冰箱过夜，次日将其移至-80 冰箱中过夜，最后投入液氮罐中保存。5.2.4 肝细胞复苏 5.2.4.1 将冻存管于 37 水浴锅中迅速解冻，待含有细胞的冻存液彻底溶化后取出移至超净工
14、作台。5.2.4.2 用 RPMI1640 培养液稀释，400 r/min 离心 5 min，弃上清液，加入培养液吹打均匀，用移液器将细胞移入加有培养液的培养皿中，放入 37、5%CO2恒温培养箱中培养。5.2.5 肝细胞传代 5.2.5.1 当细胞铺满培养皿底约 80%后，将培养皿移入超净工作台，倒掉培养皿内培养液。5.2.5.2 向培养皿中加入 0.25%胰蛋白酶，37 消化 1 min 至 80%的细胞脱壁。5.2.5.3 细胞重悬后，将一半转入新培养皿中，分别补加含 20%胎牛血清的 RPMI1640 生长培养液，置于 37、5%CO2恒温培养箱中静置培养。羊肝细胞体外培养程序流程图参
15、见附录 A。DB15/T 32592023 4 A A 附录A （资料性）羊肝细胞体外培养程序流程图 羊肝细胞体外培养程序流程图参见图A.1。图A.1 羊肝细胞体外培养程序流程图 羊只处理（见 5.2.1.1）收集过滤消化后的肝组织（见 5.2.1.7）灌注灌流液（见 5.2.1.3、5.2.1.4、5.2.1.5）去除结缔组织（见 5.2.1.6）肝脏取样后预处理（见 5.2.1.2）离心、重悬细胞（见 5.2.1.8）接种、培养（见 5.2.1.9、5.2.1.10）肝细胞分离及培养（见 5.2.1）肝细胞传代（见 5.2.5）肝细胞复苏（见 5.2.4）肝细胞冻存（见 5.2.3）肝细胞纯化（见 5.2.2）DB15/T 32592023 5 参考文献 1 冯振月,刘德福,宋佰芬等.牛肝脏细胞体外培养和传代细胞的初步鉴定J.中国细胞生物学学报，2019，41(01):80-86.2 陈阳洁,高柯欣,王智豪等.肝实质细胞的分离、鉴定及原代培养J.畜牧与饲料科学,2019,40(04):7-11.3 张钰,付亮,鲁超等.原代小鼠肝脏细胞的高效分离纯化与培养 J.现代生物医学进展,2014,14(06):1005-1008.
