1、 ICS 11.220 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 29052023 羊副流感病毒 3 型检测技术规范 Technical specification for diagnostic of capine parainfluenza virus type 3 2023-03-10 发布2023-04-10 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 29052023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：
2、内蒙古大学、内蒙古蒙微生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、内蒙古科技大学包头师范学院、吉林农业科技学院。本文件主要起草人：王炜、马艳华、王镓磊、赵丽霞、杨昱萍、郭宇、韩四娥、郭利、武有志、王岩、萨如拉、高登军、王旭红、胡薇。DB15/T 29052023 1 羊副流感病毒 3 型检测技术规范 1 范围 本文件规定了绵羊、山羊副流感3型的临床诊断、病原分离、RT-PCR、ELISA方法的诊断技术要求。本文件适用羊饲养场（户）和动物疫病检疫、诊疗单位对羊副流感病毒3型的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款
3、。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。羊副流感病毒 3 型 caprine Parainfluenza virus type 3，CPIV3 属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒（见附录A中图A.1）。4 临床诊断 感染羊主要临床症状表现为发热（体温40）、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状。病理剖检可见肺部实变。5 实验室
4、诊断 病毒分离 5.1.1 试剂耗材 牛肾细胞系（MDBK细胞系）、棉签、FBS、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养板。5.1.2 仪器 电子天平、研磨仪、台式冷冻离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱。5.1.3 病料采集 DB15/T 29052023 2 5.1.3.1 鼻拭子 用无菌棉签刮取鼻道分泌物，然后放入3 mL5 mL含1000 IU/mL青霉素1000 g/mL链霉素的DMEM 培养基的冻存管中，编号，记录，于2 8 条件下保存并尽快送往实验室。5.1.3.2 血清 使用非抗凝采血管采集新鲜血液2 mL5 mL，静置分离血清，编号，记录，于2 8 条件下保存
5、并尽快送往实验室。5.1.3.3 肺组织 疑似因CPIV3感染死亡的羊，按照NY/T 541采集肺组织样品，放入离心管，编号，记录，于2 8 条件下保存并尽快送往实验室。5.1.4 样品处理 5.1.4.1 拭子 将鼻拭子样品液冻融两次，然后以6000 r/min 离心10 min，再使用一次性注射器吸取上清经0.22 m滤膜过滤除菌，-20 以下保存备用。5.1.4.2 血清 将静置分层的血清转移到灭菌离心管，-20 以下保存备用。5.1.4.3 肺组织 取体积大小为223 cm肺组织样品，按照体积比为1:31:5的比例加入含有双抗的PBS（pH7.27.4），研磨成匀浆液，冻融两次，再以6
6、000 r/min 离心10 min，取上清经0.22 m滤膜过滤除菌，-20 下保存备用。5.1.5 细胞接种 取处理过的样品接种到长满80%的24孔板MDBK细胞，每孔200 L，置于37，含5%CO2的培养箱中吸附30 min后，加入含2%FBS或NBS的细胞培养液1 mL，同时设对照组，置于37，5%CO2培养箱，培养3 d5 d，逐日观察，记录细胞病变。按上述方法盲传35代。5.1.6 结果判定 逐日观察细胞病变，表现为细胞变圆、大量脱落、贴壁细胞变长聚集形成网状（见附录A.2）；当70%80%细胞出现病变时收获培养物，经反复冻融，以3000 r/min离心10 min，取上清进行5
7、.2的检测。RT-PCR 5.2.1 试剂耗材 移液器、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、阳性质粒（阳性对照）、灭菌超纯水（阴性对照）、引物。5.2.2 仪器 PCR仪、台式冷冻离心机、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。DB15/T 29052023 3 5.2.3 待检样品 处理后的样品或细胞培养物。5.2.4 病毒 RNA 提取 使用病毒RNA提取试剂盒提取已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品RNA，并使用核酸分析仪对RNA质量及浓度进行测定。5.2.5 RT-PCR 反应体系 5.2.5.1 RT 反
8、应 引物CPIV3-F/CPIV3-R 按照附录A.3进行引物序列合成并用无菌的DEPC处理水配制成10 mol/L。20L体系：下游引物1 L，dNTP Mixture 1L，模板RNA 2L，RNase Free dH2O 6L。65 保温5 min 后，转至冰上迅速冷却。在上述Microtube管加5Prime Script II Buffer 4 L，RNase Inhibitor(40 U/L)0.5 L(20 U)，Prime Script II RTase(200 U/L)1 L，RNase Free dH2O 4.5 L，缓慢混匀。反应条件为42 45 min，95 5 min
9、，然后冰上冷却。5.2.5.2 PCR 反应 5.2.5.2.1 反应体系 Premix溶液12.5 L，上下游引物各0.5 L，cDNA模板2 L，RNase Free dH2O 9.5 L。5.2.5.2.2 反应条件 95 预变性5 min,95 30 s，50 30 s，72 60 s，进行35个循环，72 延伸10 min。5.2.6 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳和成像 取PCR产物10 L，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压100 V，时间30 min，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果。5.2.7 结果判定 当阳性对照样品出现400 bp扩增带、阴性对照样品无扩增带出现时，试验结果
10、成立。被检样品出现400 bp扩增带为羊副流感病毒阳性，否则为阴性（见附录A中图A.2）。间接 ELISA 抗体检测 5.3.1 试剂耗材 CPIV3重组N蛋白、阴性血清、阳性血清、辣根过氧化物酶标记的驴抗羊二抗、酶标板、TMB底物显色试剂盒，抗原包被缓冲液、洗涤液、封闭液、终止液按照附录B配制，用水标准应符合GB/T 6682要求。5.3.2 仪器 水浴锅、温箱、洗板机、微量振荡器、酶标仪、移液器。5.3.3 操作方法 5.3.3.1 抗原包被 DB15/T 29052023 4 将CPIV3重组N蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.05 g/mL，每孔100 L包被96孔酶标板，4 包被16
11、 h。5.3.3.2 洗板 甩掉孔内的包被液，以洗涤液洗涤三次，用量为200 L/孔。5.3.3.3 封闭 每孔加封闭液，用量为200 L/孔，置37封闭1 h,洗涤三次。5.3.3.4 加样 阴、阳性血清和被检血清均用封闭液作200倍稀释，每个样品两个平行，每孔100 L，每块板均设阴、阳性血清及稀释液对照各2孔。加样完毕后封板，放于37 孵育1 h，洗涤三次。5.3.3.5 加酶标记抗体 每孔加入用封闭液稀释至工作浓度的酶标记抗体100 L，置37 再孵育1 h，洗涤三次。5.3.3.6 加底物溶液 加入显色底物（TMB）溶液100 L/孔，置37 避光反应15 min。5.3.3.7 终
12、止反应 加入终止液50 L/孔,混匀后即刻测量OD450值。5.3.4 结果判定 P/N 比法：被检样品(P)的吸光度值和阴性对照样品(N)值之比。P/N 1.50 判为阴性 2.0 P/N 1.50 判为可疑 P/N 2.0 判为阳性 6 综合判定 经 4 判定为疑似 CPIV3 感染病例，经 5.1 或 5.2 其中一种方法检测出 CPIV3，判为羊副流感病毒3 型感染。临床无明显特异症状的非免疫动物经 5.3 检测出 CPIV3，判为羊副流感病毒 3 型感染。DB15/T 29052023 5 A A 附录A （资料性）病毒分离鉴定 A.1 羊副流感病毒 3 型简介 羊副流感病毒3型（C
13、aprine parainfluenza virus type 3，CPIV3）属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒。数据表明，我国CPIV3在山羊和绵羊群流行率较高，可通过粪便-口腔或空气传播。羊副流感病毒3型可引起羊发热（体温大于等于40）、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状，如继发细菌或支原体感染可引起病情加重，导致呼吸道疾病综合征，造成宿主的死亡。自然感染与人工感染均可对山羊和绵羊产生致病性。病理剖检可见肺部实变。A.2 CPIV3 病变示意图 CPIV3病变示意图见图A.1。注：图A：正常MDBK细胞对照图；图B：CPIV3感染MDBK细胞病变
14、图。图A.1 CPIV3 病变示意图 A.3 PCR 引物 A.3.1 引物信息 PCR引物序列见表A.1 表A.1 PCR 引物序列 引物 序列(5-3)位置 目的片段 参考毒株 CPIV3-F CATTGAATTCATACTCAGCAC 1-400 400 bp AF035681.1 CPIV3-R AGATTGTCGCATTTRCCTC A.3.2 引物溶解 上下游引物用无菌的DEPC处理水配制成10 mol/L。A.3.3 羊副流感病毒3型非结构蛋白C基因PCR产物核苷酸序列 CATTGAATTCATACTCAGCACAGATACCCAAGAAAGTCCAATCAACGATGACGGA
15、ATCACAGCCGGAGAAACAAAACTTAGCTCAACAATCTTCCAAACAGAGTCCCAAGCAGCCAAAATATACAGGGAAAATAGTGGATCAATTGACCAAGATAGATGGGCTAGGCCATCATACAAATATACCACAAAAACAGAAAATAGAGATGTTGATCAAGAGGTTATACAGAGAGGAGATAGGCGAAGAAGCAGCGCAAGTGGTGGAADB15/T 29052023 6 CTAAGATTATGGGCGATGGAAGGGTCTCCAGAAGCAGCACGGATCCTAGCCATGGATCCCAAGTCCAGGAGGGT
16、ACTGATAACAATGAAATTGGAGAGATGGATACGAACTCTCCTCAGAGGTAAATGCGACAATCT A.4 电泳结果 电泳结果见图A.2。注：M：DL2000；1：阴性对照；2：阳性对照。图A.2 PCR 电泳图 DB15/T 29052023 7 B B 附录B （规范性）试剂的配制 B.1 抗原包被缓冲液（0.05 mol/L pH9.6 碳酸盐缓冲液）碳酸钠 0.318 g 碳酸氢钠 0.588 g 去离子水 200 mL 用0.22 m滤膜过滤除菌，室温保存备用。B.2 洗涤液PBST pH7.4 PBS 1000 mL 吐温-20 0.5 mL 现配现用。B.3 封闭液（含 2%BSA 的 PBST）pH7.4 PBS 1000 mL 吐温-20 0.5 mL BSA 20 g 现配现用。B.4 终止液 111 mL分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889 mL去离子水中，分装保存备用。
