1、 ICS 11.220 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 29072023 溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范 Technical specification for the diagnosis of mannheimia haemolytica 2023-03-10 发布2023-04-10 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布 DB15/T 29072023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古蒙
2、微生物科技有限公司、金宇保灵生物药品有限公司。本文件主要起草人：王炜、王岩、赵丽霞、韩四娥、孟凯、胡薇。DB15/T 29072023 1 溶血性曼氏杆菌病诊断技术规范 1 范围 本文件规定了溶血性曼氏杆菌病的临床诊断、细菌分离与鉴定、PCR检测和间接ELISA抗体检测等诊断技术要求。本文件适用于牛、羊饲养场(户)和动物疫病检疫、诊疗单位对牛、羊临床样本和分离培养物中溶血性曼氏杆菌的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB
3、/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926.43-2001 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。Mh：溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）LKTA：白细胞毒素蛋白A（Leukotoxin A）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）bp：碱基对（Base pair）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleoside trip
4、hosphates）Taq酶：Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）TSB：胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic soy broth）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay）5 临床诊断 流行病学 由溶血性曼氏杆菌引起的牛、羊呼吸道疾病，一年四季均可发生，秋冬季多见。DB15/T 29072023 2 临床症状 发病牛、羊主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、流涕，并伴有体温升高40 42、精神沉郁、厌食等。发病初期动物呼吸速率加快，继而出现严重的呼
5、吸困难，呼吸伴有啰音。病理变化 临床病理变化以纤维素性渗出性肺炎、大叶性肺炎和胸膜肺炎为主。病理剖检可见：病变肺呈肉样变、质地坚实、肺水肿、间质增宽、胸腔脏层和壁层均有纤维素附着、胸腔积液呈黄色或红黄色、肺与胸膜黏连，心包炎。6 样品采集 主要试剂耗材与器械 除另有规定外，所用试剂均为分析纯。试验用水均符合GB/T 6682-2008 二级水规定。TSB培养基（配制方法见附录A.1）、0.01 mol/L PBS溶液（配制方法见附录A.2）、75%酒精、无菌采样袋、5 mL冻存管、2 mL冻存管、手术剪刀、镊子。病料采集 6.2.1 将棉签伸入鼻腔或咽部刮取分泌物，所有拭子采完后分别放入盛有
6、3 mL TSB 培养基的 5 mL 冻存管中，编号，记录。采集的样品密封后，于 2 8 条件下保存并送到实验室。6.2.2 将发病牛、羊剖检后取肺和淋巴结组织，编号，记录。采集的样品密封后，于 2 8 条件下保存并送到实验室。6.2.3 采用 75%酒精对采血动物颈部静脉表面皮肤进行擦拭消毒，采集 2 mL5 mL 血液，按常规方法分离血清，编号，记录，于 2 8 条件下保存并送到实验室。7 细菌分离与鉴定 试剂耗材 绵羊血琼脂平板（配制方法见附录A.3）、革兰氏染色液、瑞氏染色液、生化鉴定管、细菌培养皿。仪器 高压灭菌锅、恒温培养箱、光学显微镜、生物安全柜、组织匀浆器或研磨器。样品处理 7
7、.3.1 将 6.2.1 中鼻拭子、咽拭子中的棉签反复挤压后取出，将鼻拭子液、咽拭子液分装到 2 mL 灭菌的冻存管中。贴标签于-80 冰箱保存。7.3.2 将组织样品分解成 223 cm 大小组织块，然后用无菌剪刀剪碎后，加入 5 mL 保存液，研磨成组织悬液，分装到 2 mL 灭菌的冻存管中。贴标签于-80 冰箱保存。细菌分离 7.4.1 在无菌条件下，将按一定比例稀释的鼻拭子液、咽拭子液或发病牛羊的肺组织材料接种 TSB 培养基中，置恒温摇床 37、120 r/min 培养 12 h16 h 后划线接种于绵羊血琼脂平板中，37 培养24 h，使之形成菌落，以供纯化鉴定用。DB15/T 2
8、9072023 3 7.4.2 取 7.4.1 中培养的圆形、光滑、湿润并伴有溶血现象的菌落，在绵羊血琼脂平板上进行划线纯培养，37 培养 24 h 后，出现上述菌落（参见附录 B 中图 B.1）。染色镜检 7.5.1 革兰氏染色 按照GB/T 14926.43-2001中3.1进行操作，可见革兰氏阴性短杆菌或球杆菌（参见附录B中图B.2）。7.5.2 瑞氏染色 取病变组织的新鲜切面制备组织触片或抹片，滴加瑞氏染色A液35滴，固定1 min；滴加瑞氏染色B液35滴，轻轻晃动玻片，静置染色3 min5 min；用蒸馏水冲洗，自然干燥后镜检，可见两极着色的短杆菌或球杆菌（参见附录B中图B.3）。生
9、化鉴定 根据伯杰细菌鉴定手册溶血性曼氏杆菌生化鉴定项目，采用相应商品化生化鉴定管进行操作和判定。溶血性曼氏杆菌可发酵麦芽糖、木糖、甘露醇和山梨醇，不发酵海藻糖，靛基质试验和脲酶试验阴性。8 PCR 检测 试剂耗材 细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖（电泳级）、DNA分子量标记DL2000、阴性对照：灭菌超纯水、阳性对照：灭活的溶血性曼氏杆菌参考菌株（CVCC4091）或gcp基因的阳性质粒（参见附录B.4）、PCR扩增用上、下游引物序列（参见附录B中表B.1）、1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR薄壁管或八联管。仪器 PCR扩增仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统。细菌基因组 DNA 提
10、取 将7.4.1中增菌培养后菌液或7.4.2中纯培养菌落用商品化试剂盒进行基因组DNA提取。提取方法按试剂盒说明书进行。PCR 扩增 每次进行PCR扩增时，除检测样品外，均需设置阳性对照和阴性对照。8.4.1 PCR 反应体系：2PCR 反应预混液 12.5 L，模板 DNA（空白对照用水代替）2 L，上下游引物各 0.5 L，ddH2O 补足至 25 L。8.4.2 PCR 反应条件：94 预变性 5 min；94 变性 30 s；50 退火 30 s；72 延伸 40 s；30 个循环，72 总延伸 10 min。PCR 产物电泳 用1TAE电泳缓冲液配制成2%琼脂糖凝胶。取5 L PCR
11、产物分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入DNA分子量标准（DL2000），以5 V/cm恒压电泳，30 min后采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。DB15/T 29072023 4 PCR 结果判定 8.6.1 阳性对照出现一条 227 bp 大小的条带，且阴性对照不出现条带。8.6.2 在满足 8.6.1 的条件下，被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条 227 bp 的条带判定为核酸阳性（+）；被检样品的 PCR 产物经电泳后不出现 227 bp 的条带判定为核酸阴性（-）（参见附录 B 中图B.6）。9 间接 ELISA 抗体检测 试剂耗材 大肠杆菌表达的溶血性曼氏杆菌LKTA重组蛋白
12、、辣根过氧化物酶标记的驴抗绵羊二抗、驴抗山羊二抗、兔抗牛二抗、Mh阳性血清、Mh阴性血清、包被缓冲液（配制方法见附录A.4）、封闭缓冲液（配制方法见附录A.5）、洗涤缓冲液（配制方法见附录A.6）、稀释缓冲液（配制方法见附录A.7）、TMB显色液（配制方法见附录A.8）、终止液（配制方法见附录A.9）。仪器 酶标仪、微量振荡器、恒温培养箱、洗板机。检测步骤 9.3.1 包被酶标板 Mh重组LKTA蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.5 g/mL，每孔100 L包被96孔酶标板，4 包被16 h。用洗涤缓冲液洗板5次，每孔200 L，每次3 min，洗涤结束后拍干。然后按200 L/孔的用量加入封
13、闭缓冲液，37 封闭2 h，用洗涤缓冲液洗板5次后拍干。9.3.2 ELISA 操作步骤 9.3.2.1 用稀释缓冲液按体积比 1:200 稀释待检血清、阳性血清和阴性血清；将稀释后血清按 100 L/孔加入反应板，每个样品两个重复，37 孵育 2 h，洗板同 9.3.1。9.3.2.2 每孔加入 100 L 的酶标抗体，37 孵育 45 min，洗板同 9.3.1。9.3.2.3 每孔加入 100 L 的 TMB 显色液，37 避光孵育 15 min。9.3.2.4 每孔加入 50 L 终止液终止显色反应，使用酶标仪测定 450 nm 波长处的 OD 值。9.3.3 试验成立条件 阳性对照O
14、D4500.5，且阴性对照OD4500.2，试验结果有效；否则，应重新进行试验。9.3.4 结果判定 在试验成立的前提下，待检样品OD4500.2，则判定该待检样品为Mh抗体阳性；待检样品OD4500.2，则判定该待检样品为Mh抗体阴性。10 综合判定 符合 5 临床特点的病例，判定为疑似 Mh 感染。符合 10.1，经 7 分离出溶血性曼氏杆菌，或经 8 检测出 Mh 核酸的，判为溶血性曼氏杆菌病。DB15/T 29072023 5 非免疫动物经 9 检测出抗体阳性，判为 Mh 感染。DB15/T 29072023 6 A A 附录A （规范性）试剂的配制 A.1 胰蛋白胨大豆肉汤培养基 准
15、确称取胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth,TSB）30 g，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，分装于三角瓶，121 高压灭菌15 min，备用。A.2 0.01 mol/L PBS 溶液 氯化钠 8.0 g 氯化钾 0.2 g 磷酸二氢钾 0.24 g 磷酸氢二钠 3.65 g pH 7.2 将上述试剂加入到800 mL蒸馏水中溶解，加水定容至1000 mL，分装三角瓶，121 高压灭菌15 min，室温保存备用。A.3 绵羊血琼脂平板 胰蛋白胨 15.0 g 大豆胨 5.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g pH 7.30.2 准确称取胰蛋白胨大豆琼脂（Try
16、ptic Soy Agar,TSA）40 g，加热搅拌溶解于1000 mL蒸馏水中，分装三角瓶，121 高压灭菌15 min，加入10%绵羊脱纤血充分混匀后倒平皿。A.4 包被缓冲液（0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液）碳酸钠 0.318 g 碳酸氢钠 0.588 g 去离子水 200 mL 用0.22 m滤膜过滤除菌，室温保存备用。A.5 封闭缓冲液（含 3%BSA 的 PBST）胰蛋白胨 17.0 g 大豆蛋白胨 3.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5 g pH 7.30.2 DB15/T 29072023 7 pH 7.4 PBS 1000
17、mL 吐温-20 0.5 mL BSA 30 g 现配现用。A.6 洗涤缓冲液PBST pH 7.4 PBS 1000 mL 吐温-20 0.5 mL 现配现用。A.7 稀释缓冲液（含 1%BSA 的 PBST）pH 7.4 PBS 1000 mL 吐温-20 0.5 mL BSA 10 g 现配现用。A.8 TMB 显色液 A.8.1 底物液A TMB（分析纯）200 mg 无水乙醇或DMSO 100 mL 蒸馏水 加至1000 mL A.8.2 底物液B 磷酸氢二钠（分析纯）14.6 g 柠檬酸（分析纯）9.33 g 0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL 蒸馏水 加至1000 mL，pH值
18、调至5.05.4 A.8.3 将底物液A和底物液B按1:1混合，即成底物显色液，现配现用。A.9 终止液 111 mL分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889 mL去离子水中，分装保存备用。DB15/T 29072023 8 B B 附录B （资料性）溶血性曼氏杆菌分离鉴定 溶血性曼氏杆菌分离培养见图B.1。图B.1 溶血性曼氏杆菌接种平板 革兰氏染色见图B.2。图B.2 革兰氏染色结果 革兰氏染色结果 图B.3 瑞氏染色结果 Gcp基因阳性质粒序列。TGGGCAATACGAACTACTCGGGGAATCAATTGATGATGCTGCCGGTGAAGCCTTTGACAAAACAGGCAAACTACTCG
19、GTTTGGATTACCCTGCCGGTGTAGCGATGTCAAAATTAGCCGAATCCGGCACGCCAAATCGTTTTAAATTCCCTCGTCCAATGACCGACAGACCGGGACTGGATTTCAGTTTCTCCGGTTTAAAAACCTTTGCTGCGAATACGATTAAAG。DB15/T 29072023 9 溶血性曼氏杆菌PCR扩增引物见表B.1。表B.1 溶血性曼氏杆菌 PCR 扩增引物序列 引物 序列(5-3)位置 目的片段 参考序列 上游引物 TGGGCAATACGAACTACTCGGG 399-625 227 bp AY839677.1 下游引物 CTTTAATCGTATTCGCAG PCR电泳图见B.6。注：M:DL 2000 Marker ladder；0：阴性对照；1:阳性对照 图B.4 PCR 电泳图
