1、 ICS 65.020.20 CCS B 31 12 天津市地方标准 DB12/T 12922023 花椰菜主要流行病害抗性鉴定技术规程 Technical standards for identification of resistance to important epidemic diseases in cauliflower2023-12-28 发布2024-02-01 实施天津市市场监督管理委员会发 布 DB12/T 12922023 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。本
2、文件起草单位：天津科润农业科技股份有限公司、天津市农业科学院。本文件主要起草人：孙德岭、姚星伟、张小丽、牛国保、单晓政、文正华、刘莉莉、江汉民。DB12/T 12922023 1 花椰菜主要流行病害抗性鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了花椰菜主要流行病害抗性鉴定的试剂、仪器设备、病原菌接种体制备、病原菌接种方法、病情调查、群体抗病性评价、鉴定记载等的要求。本文件适用于花椰菜主要流行病害抗性鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文
3、件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 试剂 BL 培养基 4.1 葡萄糖10.0 g，肉膏3.0 g，肝浸出液150.0 ml，植胨3.0 g，L-半胱氨酸HCL 0.5 g，朊蛋白胨10.0 g，可溶性淀粉0.5 g，吐温80 1.0 g，胰酪胨5.0 g，酵母膏5.0 g，溶液A（25 g KH2PO4、35 g K2HPO4溶于蒸馏水并定溶至250 ml）10.0 ml，溶液B（0.5 g FeSO47H2O、10.0 g MgSO47H20、0.337 g MnSO42H2O和0.5 g Na Cl溶于蒸馏水并定容至2
4、50 ml）5.0 ml，琼脂15.08 g，加蒸馏水至1000 ml。pH值调至7.2，高温灭菌后备用。玉米粒培养基 4.2 量取500 ml水，加入玉米粉30 g，保持温度在60 左右约1 h，用纱布过滤后，加入适量的水补足500 ml。另取500 ml水，加入琼脂17 g，加热使之慢慢融化，过滤后补足水至500 ml。两液混合后分装，高温灭菌后备用。玉米粒煮熟煮熟，高温灭菌 70%乙醇溶液 4.3 量取700 ml 95%乙醇，加水定容至950 ml，混合均匀。1%次氯酸钠溶液 4.4 量取10 ml有效氯含量10%的次氯酸钠原液加入到体积90 ml的纯净水中，混合均匀。5 仪器设备 D
5、B12/T 12922023 2 恒温摇床 5.1 回旋频率范围：40 r/min300 r/min；温度控制范围：560。恒温培养箱 5.2 温度范围：00；温度波动范围：0.5。低温冰柜 5.3 箱内温度：-15-25。灭菌锅 5.4 温度范围：0135；灭菌时间：4min120min；最高工作压力：0.22MPa。超净工作台 5.5 洁净等级：100级0.5；平均风速：0.25m/s0.6m/s。电子天平 5.6 感量0.01g。血球计数板 5.7 规格1625或者2516。离心机 5.8 5000 r/min。显微镜 5.9 物镜倍数：10、20、50、100；目镜倍数10。观察功能：
6、明场、暗场。6 病原菌接种体制备 黑腐病菌接种体制备 6.1 从花椰菜黑腐病样采用常规组织分离法分离病原菌，并对分离物进行鉴定，采用单孢分离法进行分离纯化，经柯赫（Koch）法则回接验证后，保存备用。接种前将供试菌株转接于BL液体培养基上，置于28 摇床恒温培养1天后取出，加入适量无菌水稀释，用血球计数板调整菌液浓度至1108 CFU/ml，置于4 冰箱保存备用。霜霉病菌接种体制备 6.2 采集花椰菜霜霉病病叶表面着生的霉层及其附着物用无菌水冲净，再用无菌水冲洗3遍，将洗净的病叶放入无菌培养皿中置于温度20、相对湿度95%的培养箱中黑暗培养1d。之后用湿棉球将新产生的孢子囊轻轻剥落于无菌水中制
7、成悬浮液，通过显微镜观察其孢子形态进行病原菌鉴定，利用血球计数板调整菌液浓度至1106 CFU/ml，置于4 冰箱保存备用。菌核病菌接种体制备 6.3 DB12/T 12922023 3 从花椰菜菌核病样采用常规组织分离法分离病原菌，采用单孢分离法进行分离纯化，经柯赫（Koch）法则回接验证后，保存备用。接种前将菌株置于22 培养箱中培养3天4天至长出白色菌丝进行活化，用灭菌的5 mm打孔器制备接种用菌饼备用。黑斑病菌接种体制备 6.4 从花椰菜黑斑病样采用常规组织分离法分离病原菌，采用单孢分离法进行分离纯化，经柯赫（Koch）法则回接验证后，保存备用。接种前将菌株转接到玉米粒培养基，置于25
8、，培养15天，取出光照4 h，用双层无菌纱布保湿48 h，用无菌水洗刷孢子浓度至1106 CFU/ml，置于4 冰箱保存备用。根肿病病菌接种体制备 6.5 将新鲜的花椰菜肿根取500 g搅碎，4层纱布过滤，2500 r/min离心5 min，弃上清液；用无菌水悬浮沉淀，重复3次，用血球计数板统计接种液浓度至1106 CFU/ml，置于4 冰箱保存备用。7 室内接种鉴定 鉴定室 7.1 人工接种鉴定室可以选择能进行温湿度及光照调控的人工气候室或气候箱。鉴定设计 7.2 鉴定材料随机排列，每份材料重复3次，每个重复10株苗。鉴定材料育苗 7.3 鉴定种子在1%次氯酸钠溶液中浸泡10 min，清水冲
9、洗后置于25 恒温培养箱内催芽或直接播种于育苗盘内。装入准备好的育苗基质土，防虫网内或日光温室内育苗，室内温度白天控制在2225，夜晚控制在1720，待幼苗长至4片5片真叶时进行抗病性鉴定。8 病原菌接种 黑腐病接种 8.1 采用喷雾方法接种。待花椰菜幼苗长至4片5片真叶时，移到人工气候室内保湿一夜，使其叶缘出现露珠，第二天制备接种菌液并用小型喷雾器进行喷雾接种，均匀喷施至叶片上，在人工气候室内24 h相对湿度95%100%，24 h后降低相对湿度至80%85%，28，14 h光照，7天后调查记载发病情况。霜霉病接种 8.2 采用喷雾法接种。将菌液倒入小型喷雾器中，在接种材料的叶片背面喷洒，每
10、株100 L。接种后将温度控制在1825，黑暗条件下相对湿度95%100%保湿24 h，24 h后降低相对湿度至80%85%，25，14 h光照，7天后进行发病情况调查。菌核病接种 8.3 采用贴菌片接种。当花椰菜幼苗4片5片真叶时移到人工气候箱内保湿过夜，使其叶面湿润，将直径5 mm菌片带菌丝面贴于幼苗的第3片真叶，用保鲜膜保湿，接种后24 h保持在2023，相对湿度95%100%，24 h后降低相对湿度至80%85%，7天后进行病害调查。DB12/T 12922023 4 黑斑病接种 8.4 采用喷雾法接种，将制备好的孢子悬液均匀喷洒于幼苗叶片表面，每株100 L。接种后将温度控制在20
11、左右，黑暗条件下相对湿度95%100%，24 h后降低相对湿度至80%85%，25，14 h光照，7天后进行发病情况调查。根肿病接种 8.5 采用伤根灌菌法。取4片5片真叶的花椰菜幼苗，在幼苗根部一侧用灭菌刀片将部分根轻轻划伤，给根系造成机械伤害，将1108 CFU/ml接种菌液5 ml灌入伤根部位。接种6周后进行发病情况调查。9 病情调查 病情级别9.1 花椰菜主要流行病害病情级别划分见表1。表1 花椰菜主要流行病害病情级别划分 病情级别 黑腐病 霜霉病 菌核病 黑斑病 根肿病 0 无病症 无病症 无病症 无病症 无病症 1级 水孔处有黑色枯死点，无扩展 接种点上有稀疏病斑，不扩散 病斑仅出
12、现在接种点处，无扩展 病斑面积占整个叶面积5%以下 根肿只附着在侧根，数 量 占 根 系 全 部 的1%10%3级 病斑从水孔向外扩展，占叶面积5%以下 叶片有较多病斑，所属凹陷，叶片背面无霉层 发病叶片病斑面积占叶片面积的10%以下 病斑面积占整个叶面积5%10%主根有根肿附着，侧根 上 根 肿 数 量 占10%25%以上 5级 病斑从水孔向外扩展，占叶面积5%25%叶片病斑向四处扩散，霉层较少 发病叶片病斑面积占叶片面积的10%30%病斑面积占整个叶面积11%20%根 肿 数 量 占 25%50%，主根有附着 7级 病斑从水孔向外扩展，占叶面积26%50%病 斑 面 积 达 50%70%，
13、霉层较多 发病叶片病斑面积占叶片面积的31%50%病斑面积占整个叶面积21%50%根 肿 数 量 占 51%75%，主根有附着 9级 病斑从水孔向外扩展，占叶面积50%以上 病斑面积70%以上，有大量霉层。发病叶片病斑面积占叶片面积的50%以上 病斑面积占整个叶面积50%以上 根肿数量占75%以上，主根上有根肿附着 病情指数9.2 调查每份鉴定材料接种叶片或根系发病情况，根据病害症状描述，逐份材料进行调查，记载接种病情级别，按公式（1）计算得出病情指数。计算结果取3次重复的平均值。DI=（）100 (1)式中：DI病情指数；s各病情级别的代表数值；n各病情级别的病叶数或者株数，单位为个或株；N
14、调查的总叶数或者总株数，单位为个或株；S最高病情指数的代表数值。DB12/T 12922023 5 10 群体抗病性评价 抗病性评价标准 10.1 花椰菜主要流行病害抗性鉴定评价标准见表2。表2 花椰菜主要流行病害抗性评价标准 病情级别 黑腐病 霜霉病 菌核病 黑斑病 根肿病 免疫（I）DI=0.00 DI=0.00 DI=0.00 DI=0.00 DI=0.00 高抗（HR）0DI11.11 0DI11.11 0DI5 0DI15 0DI12.5 抗病（R）11.11DI33.33 11.11DI33.33 5DI20 15DI30 12.5DI25 中抗（MR）33.33DI55.55 3
15、3.33DI55.55 20DI40 30DI45 25DI45 感病（S）55.55DI67.77 55.55DI77.77 40DI70 45DI70 45DI65 高感（HS）DI67.77 ID77.77 ID70 DI70 DI65 有效性判别 10.2 感病对照材料达到其感病程度，抗病对照材料与实际抗性程度相符，该批次抗病鉴定结果视为有效。鉴定材料处理10.3 鉴定完毕后，将花椰菜发病植株、残体、鉴定用基质集中进行无害化处理。11 鉴定记载 花椰菜主要流行病害鉴定记录表见附录A。DB12/T 12922023 6 A A 附录A （规范性）花椰菜主要流行病害鉴定附表 表A.1 花椰菜主要流行病害鉴定记录见表A.1。表A.1 花椰菜主要流行病害鉴定记录表 编号 品种/种质名称 来源 重复区号 病情级别 病情指数 平均指数 0 1 3 5 7 9 播种日期接种日期接种生育期接种病原菌分离物编号株系类型调查日期
