1、ICS 65.020CCS B05DB6108榆林市地方标准DB6108/T 562023马铃薯脱毒试管苗生产技术规程2023-06-02 发布2023-07-02 实施榆林市市场监督管理局发 布DB6108/T 5620231DB6108/T 562023I前 言本文件按照 GB/T1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由榆林市农业农村局提出并归口。本文件起草单位：榆林市农业科学研究院、定边县科发马铃薯良种繁育有限责任公司。本文件主要起草人：张艳艳，张春燕，童霄丽，方玉川，杜清荣，张媛媛，白艳艳，拓小波，张强，陈丽娟，李东东，薛伟，薛皎，闫陆飞
2、，高慧，王毛毛，韩芬，付永飞，朱继宇，贺海军，王彦梅，胡晓燕，白延生，乔文渊，李小娟，张蓉蓉，刘小林。本文件由榆林市农业科学研究院负责解释。本文件为首次发布。联系信息如下：单位：榆林市农业科学研究院电话：0912-3359657邮箱地址：地址：陕西省榆林市榆阳区上郡南路14号邮编：719000DB6108/T 5620231马铃薯脱毒试管苗生产技术规程1范围本文件规定了马铃薯脱毒试管苗生产的车间建设、脱毒流程、试管苗繁育、档案建立。本文件适用于榆林市马铃薯脱毒试管苗生产。2规范性引用文件下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文
3、件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 3095环境空气质量标准GB/T 29375-2012马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程GB 50073-2001洁净厂房设计规范NY/T 401-2000脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程3术语和定义GB/T 293752012规定的术语和定义适用于本文件。4生产车间建设4.1立地条件选址可按照GB 50073-2001中4.1的规定执行，宜建在供电稳定、四周空气流通较好，自然光源充足，没有空气污染和水源污染的地域。4.2车间布局4.2.1车间布局可按照 GB 50073-2001 中 4.2 的规定执行。4.2.2须配备配制室、灭菌室、清洗
4、室、更衣室、预制室、接种室、培养室等。配制室、灭菌室、清洗室与更衣室、预制室、接种室、培养室等应绝对隔离。4.3卫生要求4.3.1空气质量不低于 GB 3095 中对总悬浮颗粒物（TSP）二级要求。4.3.2生产车间要保持干净、清洁，接种室和培养室应定期消毒，消毒要求如下：a)大消毒。1 次/月，每 m空间用 40%甲醛溶液 5mL+高锰酸钾 5g 混合熏蒸。密闭 3d 后，再通风1d；b)日常消毒。1 次/d，接种室接种前一天晚上用 50mg/L ClO2 熏蒸。5脱毒流程5.1培养基制备DB6108/T 56202325.1.1培养基配制：在 MS 基本培养基（见附录 A）中按照不同比例添
5、加 NAA、6-BA、GA3 及 D-泛酸钙等植物生长调节剂，并分装于培养瓶中。5.1.2培养基消毒：培养瓶加盖后置于高压蒸汽灭菌锅 121条件下灭菌 20min。5.2剥离材料的选择和处理5.2.1选择：在生长季节选择具有品种典型性状的健康单株，收获后选取健康块茎。5.2.2处理：块茎通过自然休眠或者激素处理后，在室温内进行先暗光后散射光的催芽处理。5.3茎尖剥离5.3.1无菌工作条件创造5.3.1.1组培室用 4.3.2 的方法消毒后，再用紫外线灯照射 40min。5.3.1.2无菌操作台要提前 2h 打开风机和紫外灯杀菌。5.3.1.3工作人员用硫磺皂洗手，75%酒精擦拭消毒。5.3.1
6、.4操作器具在高压蒸汽灭菌锅内 121条件下灭菌 20min，置于无菌操作台上备用。5.3.2病毒钝化5.3.2.1物理钝化：将马铃薯薯块在 36条件下处理 4 周6 周或用紫外线照射脱毒材料 10 min。5.3.2.2化学钝化：在培养基中加入病毒唑，使病毒钝化失活。5.3.3茎尖消毒经催芽处理，待芽萌发至 2cm3cm 时，选取健壮芽，用解剖刀切下，芽段用自来水冲洗 40min 以上，再用 75%的酒精浸蘸 30s，放入无菌杯内用 6%的次氯酸钠溶液浸泡 10 min，最后用无菌水冲洗 3次。5.3.4茎尖剥离及接种将茎尖放在无菌滤纸上吸干水分，在10倍解剖镜下用解剖针剥取带1个2个叶原基
7、的茎尖（0.1mm0.3mm），迅速按无菌操作程序接入培养基中。5.4茎尖培养温度2025，光照强度2000Lx3000Lx，光照时间16h/d，培养90d140d。当看到明显生长的小茎，叶原基形成可见的小叶，转入无生长调节剂的培养基中。小苗继续生长并形成根系，发育成3个4个叶片的小植株，即可继续扩繁。5.5病毒检测以单株为系进行扩繁，苗数达150株200株时，随机抽取3个4个样本，每个样本10株15株，进行病毒检测，采用NY/T 401中的酶联免疫吸附试验法(ELISA)和RT-PCR法检测确认不带有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM和PSTVd。5.6脱毒苗试种病毒检测合格的
8、试管苗在网棚中用无土栽培的方式进行试种，与大田种植的同品种马铃薯植株和块茎的各个指标进行比对：a)苗期观察植株叶片形状、颜色，茎秆颜色以及花色、花型等指标。DB6108/T 5620233b)收获后观察薯型、芽眼、薯皮、薯肉颜色等指标。注：指标一致，即可视为该脱毒苗保持了品种的生物学性状，可作为核心种苗进行扩大繁殖。6试管苗的繁育6.1培养基制备将MS培养基配制成液，装入器皿（MS培养基配方附录A），置于121高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。6.2组培苗处理将组培苗置于超净工作台上，器皿表面用75%的酒精擦试消毒，取出组培苗，按单茎切段，每个段带一片小叶摆放在培养基面上。6.3组培苗快繁6.3.
9、1基础苗繁育6.3.1.1按组培苗繁育的方法配制培养基和处理组培苗。6.3.1.2切段底部（根部）不作为基础苗，直接转入移栽用苗培养，其它各段作为基础苗进行繁殖。6.3.1.3培养温度 1520，光照强度 2000Lx3000Lx，光照时间 10 h/d 14h/d。6.3.1.4培养周期 30 d40d。6.3.2定植苗繁育6.3.2.1按组培苗繁育的方法配制培养基和处理组培苗。6.3.2.2培养温度 1525，光照强度 3000Lx4000Lx，光照时间 14 h/d 16h/d。6.3.2.3培养周期 15 d20d，苗高 5cm 以上即可定植。7档案建立建立茎尖脱毒和试管苗工厂化生产档
10、案，档案保存不少于2y。DB6108/T 5620234附录A(资料性附录)MS 培养基配方MS类型成分用量（mg/L)A大量元素硝酸铵(NH4NO3)硝酸钾(KNO3)磷酸二氢钾(KH2PO4)硫酸镁(MgSO47H2O)氯化钙(CaCl22H2O)3300038000340074008800B铁盐硫酸亚铁(FeSO47H2O)乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)55707450C微量元素碘化钾(KI)钼酸钠(Na2MoO42H2O)硫酸铜(CuSO45H2O)氯化钴(CoCl26H2O)硫酸锰(MnSO44H2O)硫酸锌(ZnSO47H2O)硼酸(H3BO3)1665055446017201240D有机物盐酸硫胺素(VB1)盐酸吡哆素(VB6)甘氨酸烟酸肌醇2010040010020000E糖类蔗糖琼脂300007_
