1、I C S 6 5.0 2 0C C S B 1 553云 南 省 地 方 标 准D B 5 3/T 1 0 8 2 2 0 2 2高 粱 花 叶 病 毒 R T-P C R 检 测 技 术 规 程2 0 2 2-0 5-2 0 发 布 2 0 2 2-0 8-2 0 实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 5 3/T 1 0 8 2 2 0 2 2I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能
2、 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 云 南 省 农 业 科 学 院 甘 蔗 研 究 所 提 出。本 文 件 由 云 南 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会（Y N T C 0 7）归 口。本 文 件 起 草 单 位：云 南 省 农 业 科 学 院 甘 蔗 研 究 所。本 文 件 主 要 起 草 人：李 婕、黄 应 昆、单 红 丽、王 晓 燕、张 荣 跃、仓 晓 燕、王 长 秘、尹 炯、罗 志 明。D B 5 3/T 1 0 8 2 2 0 2 21高 粱 花 叶 病 毒 R T-P C R 检 测 技 术 规 程1
3、范 围本 文 件 规 定 了 高 粱 花 叶 病 毒 R T-P C R 检 测 方 法 中 涉 及 的 仪 器 与 耗 材、试 剂、检 测 样 品 的 取 样 及 对 照 设置、检 测 方 法 和 结 果 判 定 等。本 文 件 适 用 于 高 粱 花 叶 病 毒（S o r g h u m m o s a i c v i r u s，S r M V）侵 染 的 植 物 样 品 的 R T-P C R 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件本 文 件 没 有 规 范 性 引 用 文 件。3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1高 粱 花 叶 病 毒 S
4、 o r g h u m m o s a i c v i r u s高 粱 花 叶 病 毒（S o r g h u m m o s a i c v i r u s，S r M V）属 于 马 铃 薯 Y 病 毒 科（P o t y v i r i d a e）马 铃 薯 Y 病 毒 属（P o t y v i r u s），是 引 起 甘 蔗 花 叶 病 的 主 要 病 毒 之 一，英 文 名 称 为 S o r g h u m m o s a i c v i r u s，缩 写 为 S r M V，参 见 附 录 A。3.2R T-P C R反 转 录 聚 合 酶 链 式 反 应（R e v
5、 e r s e T r a n s c r i p t i o n P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n，R T-P C R）的 简 称，是 一种 在 体 外 利 用 反 转 录 酶 将 R N A 反 转 录 为 c D N A，再 以 c D N A 为 模 板 进 行 P C R 扩 增，以 获 得 R N A 特 定 片 段。4 仪 器 与 耗 材4.1 仪 器主 要 仪 器 包 含 电 子 天 平、恒 温 水 浴 锅、高 速 台 式 冷 冻 离 心 机、蛋 白/核 酸 分 析 仪、P C R 扩 增 仪、涡旋 混 匀 器、微 波
6、 炉、电 泳 仪、水 平 电 泳 槽、凝 胶 成 像 仪、可 调 微 量 移 液 器、研 钵 等。4.2 耗 材无 核 酸 酶（N u c l e a s e-f r e e）的 1.5 m L 和 2.0 m L 离 心 管 及 0.2 m L P C R 管 等。5 试 剂5.1 常 规 试 剂液 氮、焦 碳 酸 二 乙 酯（D E P C）灭 菌 水 或 者 R N a s e-f r e e 水、植 物 总 R N A 提 取 试 剂 盒、三 氯 甲 烷、7 0%乙 醇、异 丙 醇、无 水 乙 醇 等。D B 5 3/T 1 0 8 2 2 0 2 225.2 R T-P C R 试
7、剂O l i g o(d T)1 8 引 物（0.5 g/L），R T-P C R 反 转 录 试 剂 盒，含 溴 酚 蓝 染 料 的 2 E a s y T a q P C R S u p e r M i x聚 合 酶 混 合 物。5.3 引 物5.3.1 上 游 引 物 S r M V-F：5-C A T C A R G C A G G R G G C G G Y A C-3，下 游 引 物 S r M V-R：5-T T T C A T C T G C A T G T G G G C C T C-3（R=A/G，Y=C/T）。5.3.2 用 无 核 酸 酶 的 水 将 上、下 游 引 物
8、 分 别 配 制 成 浓 度 为 2 0 M 的 水 溶 液。5.3.3 目 的 扩 增 片 段 约 为 8 2 0 b p。5.4 电 泳 缓 冲 液 的 配 制按 以 下 步 骤 配 制 电 泳 缓 冲 液：a)称 取 2 4 2 g 的 T r i s，先 用 3 0 0 m L 的 d d H 2 O 搅 拌 溶 解 后，加 1 0 0 m L 0.5 m o l/L 的 E D T A 水 溶 液配 制 5 0 T A E 储 存 液；b)用 d d H 2 O 将 储 存 液 稀 释 5 0 倍 配 制 1 T A E 工 作 液；c)称 取 T r i s 1 0 8 g、硼 酸
9、 5 5 g、7.4 4 g 的 N a 2 E D T A 2 H 2 O，加 入 4 0 m L 0.5 m o l/L 的 E D T A 水 溶 液，再 用 d d H 2 O 定 容 至 1 0 0 0 m L 配 制 1 0 T B E 储 存 液；d)用 d d H 2 O 将 储 存 液 稀 释 2 0 倍 配 制 0.5 T B E 工 作 液。5.5 扩 增 产 物 电 泳 检 测 试 剂1%左 右（W/V）琼 脂 糖，核 酸 染 料。6 检 测 样 品 的 取 样 及 对 照 设 置6.1 阳 性 对 照以 S r M V 侵 染 的 植 物 样 品 作 为 阳 性 对
10、照。6.2 阴 性 对 照以 健 康 植 物 样 品 作 为 阴 性 对 照。6.3 空 白 对 照以 灭 菌 d d H 2 O 作 为 空 白 对 照。6.4 取 样戴 一 次 性 手 套 采 集 甘 蔗 叶 片 或 芽 作 为 待 检 样 品，且 每 采 一 个 样 品 跟 换 一 次 手 套，过 程 中 不 应 交 叉 污染。将 采 的 集 样 品 放 入 自 封 袋 中，编 号，冷 藏 运 输 到 实 验 室 液 氮 速 冻 后，于-8 0 冰 箱 保 存 备 用。7 检 测 方 法7.1 总 R N A 提 取总 R N A 提 取 步 骤 如 下：D B 5 3/T 1 0 8
11、2 2 0 2 23a)戴 一 次 性 手 套 称 取 0.1 g 待 测 样 品 置 于 灭 菌 研 钵 中，液 氮 冷 冻，研 磨 至 粉 状 后 放 入 1.5 m L 离 心管 中，并 对 每 支 管 进 行 编 号；b)用 核 酸 提 取 试 剂 盒 提 取 样 品 总 R N A，按 提 取 试 剂 使 用 说 明 书 进 行 操 作；c)提 取 后 用 蛋 白/核 酸 分 析 仪 测 定 R N A 相 对 浓 度，当 A 2 6 0/A 2 8 0 比 值 为 1.8 2.0 时，可 用 于R T-P C R 检 测。7.2 反 转 录按 以 下 步 骤 进 行 反 转 录：a
12、)以 提 取 的 总 R N A 为 模 板，在 P C R 管 中 按 序 依 次 加 入：O l i g o(d T)1 8 引 物 约 0.5 L、R N A 模 板约 2.0 L（约 2 0 0 n g）、反 转 录 试 剂、灭 菌 D E P C 水 补 足 1 0 L 反 转 录 反 应 体 系，混 匀；b)2 0 0 0 r p m 快 速 离 心 1 0 s，放 入 P C R 仪 合 成 c D N A，按 R T-P C R 试 剂 盒 说 明 书 进 行 操 作。7.3 P C R 扩 增按 以 下 步 骤 进 行 P C R 扩 增：a)以 合 成 的 c D N A
13、第 一 链 为 模 板，在 P C R 管 中 按 序 依 次 加 入：灭 菌 D E P C 水 7.2 L、含 溴 酚 蓝染 料 的 2 E a s y T a q P C R S u p e r M i x 聚 合 酶 混 合 物 1 0 L、反 转 录 产 物（c D N A）2.0 L、0.4 L上 游 引 物 S r M V-F（2 0 M）、0.4 L 下 游 引 物 S r M V-R（2 0 M），制 成 2 0 L P C R 反 应 体 系，2 0 0 0 r p m 快 速 离 心 1 0 s 混 匀 后 放 进 P C R 仪 进 行 P C R 扩 增；b)9 4
14、预 变 性 5 m i n；c)9 4 变 性 3 0 s，6 0 退 火 3 0 s，7 2 延 伸 1 m i n，3 5 个 循 环；d)7 2 延 伸 1 0 m i n。7.4 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测按 以 下 步 骤 进 行：a)用 1 T A E 或 0.5 T B E 缓 冲 液 配 制 1.0%左 右（W/V）琼 脂 糖 胶，加 热 至 琼 脂 糖 完 全 熔 化；b)待 凝 胶 冷 却 至 5 0 6 0 时，在 1 0 0 m L 琼 脂 糖 胶 中 加 入 适 量 的 核 酸 染 料，混 匀；c)将 凝 胶 倒 入 置 有 样 品 梳 的 制 胶 板 上；d
15、)待 凝 胶 充 分 冷 却 后，拔 除 样 品 梳，将 制 胶 板 同 制 好 的 琼 脂 糖 凝 胶 一 并 放 入 装 有 1 T A E 或0.5 T B E 电 泳 缓 冲 液 的 水 平 电 泳 槽；e)每 个 样 品 取 1 0 L P C R 扩 增 产 物 加 入 样 品 梳 孔，在 其 中 一 个 样 品 梳 孔 中 加 入 6 L D N A 分 子 量标 准（M a r k e r E），1 3 0 V 恒 定 电 压 下 电 泳 2 5 m i n；f)电 泳 结 束 后，把 胶 板 取 出 用 凝 胶 成 像 仪 观 察、拍 照。8 结 果 判 定阳 性 对 照 在
16、 8 2 0 b p 左 右 有 条 带，阴 性 对 照 和 空 白 对 照 无 条 带，则 检 测 结 果 有 效。R T-P C R 检 测 结 果判 定 详 见 表 1。D B 5 3/T 1 0 8 2 2 0 2 24表 1 R T-P C R 检 测 结 果 判 定判定条件结果判定 R T-P C R 产 物在 8 2 0 b p 左右有无条带出现（参见附录B）序号 空白对照 阴性对照 阳性对照 检测样品1 无 无 有 有检 测 结 果 有 效，被 检 测 甘 蔗 样 品 感 染 高 粱 花叶病毒2 无 无 有 无检 测 结 果 有 效，被 检 测 甘 蔗 样 品 未 感 染 高
17、粱花叶病毒3 有/无 有/无 无 有/无检 测 结 果 无 效，将 实 验 中 的 所 有 试 剂 更 换，并 重 新 提 取 检 测 样 品 R N A，进 行 R T-P C R 检测D B 5 3/T 1 0 8 2 2 0 2 25附 录 A（资 料 性）高 粱 花 叶 病 毒A.1 高 粱 花 叶 病 毒高 粱 花 叶 病 毒（S o r g h u m m o s a i c v i r u s）属 于 马 铃 薯 Y 病 毒 科（P o t y v i r i d a e）马 铃 薯 Y 病 毒 属（P o t y v i r u s）成 员，英 文 名 称 为 S or g h
18、 um m os a i c vi r us，缩 写 为 S r M V。A.2 病 原 特 征A.2.1 病 毒 粒 体S r M V 病 毒 粒 体 呈 弯 曲 线 状，无 包 膜，螺 旋 对 称 结 构，大 小 为（7 5 0 8 5 0）n m（1 3 1 5）n m。A.2.2 基 因 组基 因 组 由 一 条 正 单 链 R N A 组 成，大 小 约 1 0 k b，编 码 一 个 多 聚 蛋 白，经 蛋 白 酶 水 解 后 可 产 生 1 0 个 成熟 的 蛋 白 质，从 N 端 到 C 端 依 次 是 P 1、H C-P r o、P 3、6 K 1、C I、6 K 2、N I
19、 a-V P g、N I a-P r o、N I b 和 C P，还在 P 3 氨 基 端 编 码 区 发 生 移 码 翻 译 出 P 3 N-P I P O。A.3 寄 主在 自 然 条 件 下，S r M V 可 侵 染 甘 蔗（S a c c h a r u m o f f i c i n a r u m）、高 粱（S o r g h u m b i c o l o r）、玉 米（Z e am a y s）和 细 叶 芒（M i s c a n t h u s s i n e n s i s）等 禾 本 科 植 物。A.4 病 害 症 状S r M V 侵 染 为 害 叶 片，花 叶 症
20、 状 主 要 表 现 在 叶 片 上，尤 以 新 叶 基 部 症 状 最 为 明 显；病 毒 可 系 统 侵 染，导 致 整 丛 蔗 株 发 病，叶 色 褪 绿，产 生 许 多 与 叶 脉 平 行 的 黄 绿 相 间 不 规 则 条 纹，大 小 长 短 不 一，布 满 叶 片，与 正 常 部 分 参 差 间 隔 成“花 叶”；病 株 生 长 差、矮 化、分 蘖 少，汁 液 量 减 少。A.5 传 播 途 径S r M V 可 通 过 带 毒 的 无 性 繁 殖 材 料（种 质）、田 间 病 株 及 种 传 等 方 式 传 播，可 通 过 收 获 机 械、刀 具和 摩 擦 接 种 等 方 式 传
21、 播，也 可 被 多 种 蚜 虫（甘 蔗 棉 蚜 C e r a t o v a c u n a l a n i g e r a、黑 豆 蚜 A p h i s c r a c c i v o r a、桃 蚜 M y z u s p e r s i c a e 和 玉 米 蚜 R h o p a l s i p h u m m a i d i s）以 非 持 久 方 式 传 播。A.6 分 布主 要 分 布 于 印 度、美 国、巴 西、阿 根 廷、日 本、菲 律 宾、澳 大 利 亚、中 国 等 国 家。D B 5 3/T 1 0 8 2 2 0 2 26附 录 B（资 料 性）高 粱 花 叶 病 毒 R T-P C R 检 测 电 泳 图高 粱 花 叶 病 毒 R T-P C R 检 测 电 泳 图 见 图 B.1。M：M a r k e r E；1-5：感 染 高 粱 花 叶 病 毒 的 甘 蔗 样 品；6-1 0：未 感 染 高 粱 花 叶 病 毒 的 健 康 甘 蔗 样 品；P C：S r M V 阳 性 对 照；N C：阴 性 对 照；C K：空 白 对 照。图 B.1 高 粱 花 叶 病 毒 R T-P C R 检 测 电 泳 图DB53/T 1 0 8 2 2 0 2 2
