1、I C S 6 5.0 2 0.3 0C C S B 4 353云 南 省 地 方 标 准D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 2D B 5 3/T 4 4 7.4-2 0 1 2云 岭 牛 第 4 部 分：胚 胎 移 植2 0 2 2-0 5-2 0 发 布 2 0 2 2-0 8-2 0 实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 2I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。本 文 件 为
2、D B 5 3/T 4 4 7 2 0 2 2 云 岭 牛 的 第 4 部 分。D B 5 3/T 4 4 7 已 经 发 布 了 以 下 部 分：第 1 部 分：品 种；第 2 部 分：养 殖 场 建 设 规 范；第 3 部 分：人 工 授 精；第 4 部 分：胚 胎 移 植；第 5 部 分：体 外 胚 胎 生 产；第 6 部 分：饲 养 管 理；第 7 部 分：饲 草 加 工 与 调 制 技 术；第 8 部 分：育 肥 技 术；第 9 部 分：疫 病 防 治；第 1 0 部 分：档 案 管 理；第 1 1 部 分：胴 体 生 产、评 定 及 分 割 技 术。本 文 件 代 替 D B 5
3、3/T 4 4 7.4-2 0 1 2 B M Y 牛 第 4 部 分：胚 胎 移 植 技 术 规 范，与 D B 5 3/T 4 4 7.4-2 0 1 2相 比，除 结 构 调 整 和 编 辑 性 改 动 以 外，主 要 技 术 变 化 如 下：a)更 改 标 准 名 称 为“云 岭 牛；b)更 改 全 文“B M Y 牛”为“云 岭 牛”；c)“术 语”中 增 加 了 英 文 名 称，更 改 了 3.5 表 述（见 第 3 章）；d)更 改 了“胚 胎 移 植 的 基 本 原 则”中 部 分 表 述（见 4.2）；e)更 改 了“供 体 牛 饲 养 管 理”中 部 分 表 述（见 5.2
4、.3）；f)更 改 了“超 排 方 法”中 部 分 表 述（见 6.1.2.1、6.1.2.3）；g)更 改 了“冲 胚 液 的 配 制”中 部 分 表 述（见 7.2.3）；h)更 改 了“冲 胚 步 骤”中 部 分 表 述（见 7.2.4.4）；i)更 改 了“检 胚”表 述 顺 序（见 8.1）；j)更 改 了“胚 胎 的 质 量 鉴 定”中 部 分 表 述（见 8.2.1.1、8.2.1.2、8.2.1.3）；k)更 改 了“胚 胎 解 冻”中 部 分 表 述，并 将 细 管 装 枪 及 移 植 部 分 内 容 并 入 1 0.5.4（见 9.2、1 0.5.4.1、1 0.5.4.2
5、）。本 文 件 由 云 南 省 草 地 动 物 科 学 研 究 院 提 出。本 文 件 由 云 南 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会（Y N T C 0 7）归 口。本 文 件 起 草 单 位：云 南 省 草 地 动 物 科 学 研 究 院。本 文 件 主 要 起 草 人：黄 必 志、和 占 星、王 安 奎、金 显 栋、张 继 才、刘 建 勇、王 喆、黄 梅 芬、亐开 兴、杨 世 平、赵 刚、袁 希 平、杨 凯、李 乔 仙、杨 寿 军。本 文 件 及 其 所 代 替 文 件 的 历 次 版 本 发 布 情 况 为：2 0 1 2 年 首 次 发 布；本 次 为 第 一 次 修 订。D
6、 B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 2I I I引 言D B 5 3/T 4 4 7-2 0 2 2 云 岭 牛 是 以 2 0 1 4 年 1 2 月 国 家 审 定 新 品 种“云 岭 牛”为 载 体 制 定 的 综 合 养殖 标 准，旨 在 从 品 种、养 殖 场 建 设、繁 殖、管 理、饲 草 加 工 调 制、育 肥、疫 病、档 案 和 胴 体 评 定 分割 等 方 面 指 导 和 规 范 云 岭 牛 的 养 殖，带 动 云 岭 牛 规 范 化、标 准 化、产 业 化 发 展 的 同 时，可 提 高 养 殖场（户）养 殖 水 平 和 养 殖 效 益，促 进 云 南 肉 牛 产
7、 业 高 质 量 发 展。D B 5 3/T 4 4 7-2 0 2 2 由 十 一 个 部 分 构 成。第 1 部 分：品 种。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 特 征 和 特 性、生 产 性 能、种 牛 等 级 和 良 种 登 记，适 用于 云 岭 牛 品 种 鉴 定 和 种 牛 等 级 评 定。第 2 部 分：养 殖 场 建 设 规 范。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 选 址、规 划 与 布 局、牛 舍 建 设 和 辅 助 设 施建 设 等 技 术 要 求。第 3 部 分：人 工 授 精。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 种 公 牛 选 择、母 牛 的 初 配 年 龄 与 发 情
8、 鉴 定、输 精方 法、母 牛 妊 娠 诊 断 等 技 术 要 求。第 4 部 分：胚 胎 移 植。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 快 速 扩 繁 受 体 牛 同 期 发 情、供 体 牛 超 数 排 卵 与 输精、胚 胎 回 收、胚 胎 质 量 鉴 定、胚 胎 冷 冻 保 存 与 解 冻、胚 胎 移 植、受 体 牛 妊 娠 诊 断 等 技 术 要求。第 5 部 分：体 外 胚 胎 生 产。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 供 体 牛 的 选 择 与 饲 养 管 理、卵 母 细 胞 的 获 取、卵 母 细 胞 的 检 出 与 分 级、卵 母 细 胞 的 I V M、卵 母 细 胞 的 I
9、V F、受 精 卵 的 I V C 等 技 术 要 求。第 6 部 分：饲 养 管 理。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 饲 养 管 理 的 基 本 要 求 以 及 牛 场 卫 生、各 类 牛 的 饲养 管 理 等 技 术 要 求。第 7 部 分：饲 草 加 工 与 调 制 技 术。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 养 殖 过 程 中 青 贮 饲 料、秸 秆 氨（碱）化 饲 料、青 干 草 饲 料 的 加 工 调 制 技 术 要 求。第 8 部 分：育 肥 技 术。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 优 质 牛 肉 生 产 和 雪 花 牛 肉 生 产 技 术 要 求。第 9 部 分：疫 病
10、 防 治。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 的 生 物 安 全、牛 场 消 毒、疫 病 防 治 及 无 害 化 处 理等 技 术 要 求。第 1 0 部 分：档 案 管 理。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 养 殖 过 程 中 建 档 范 围、内 容 及 档 案 管 理 的 技 术 要求。第 1 1 部 分：胴 体 生 产、评 定 及 分 割 技 术。目 的 在 于 确 立 云 岭 牛 胴 体 生 产、评 定、分 割 以 及 分割 肉 包 装 等 技 术 要 求。D B 5 3/T 4 4 7-2 0 2 2 包 含 的 十 一 部 分 内 容 均 是 符 合 生 产 实 际 需 要，涵
11、盖 了 生 产 环 节 中 的 品 种、养殖 场 建 设、繁 殖、饲 养 管 理、饲 草 加 工 调 制、育 肥、疫 病 防 治、档 案 管 理 和 胴 体 生 产、评 定 及 分 割多 方 面 技 术。该 标 准 可 规 范 云 岭 牛 从 养 殖 场 到 牛 肉 产 品 的 全 系 列 生 产 技 术，充 分 发 挥 云 岭 牛 生 产 性能，提 高 养 殖 水 平，促 进 规 模 化 标 准 化 养 殖 的 构 建 和 肉 牛 产 业 的 发 展。D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 21云 岭 牛 第 4 部 分：胚 胎 移 植1 范 围本 文 件 规 定 了 胚 胎 移 植
12、 的 要 求、供 体 牛 的 选 择 与 饲 养 管 理、供 体 牛 的 超 排 及 输 精、胚 胎 回 收、胚 胎质 量 鉴 定、胚 胎 的 冷 冻 保 存 与 解 冻、胚 胎 移 植、受 体 牛 的 妊 娠 诊 断 等 技 术 要 求。本 文 件 适 用 于 云 岭 牛 的 超 数 排 卵 及 胚 胎 移 植（M O E T）的 各 个 环 节。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文
13、 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B 4 1 4 3 牛 冷 冻 精 液D B 5 3/T 2 4 7.3 肉 牛 养 殖 综 合 标 准 第 3 部 分：繁 殖 技 术D B 5 3/T 4 4 7.3 云 岭 牛 第 3 部 分：人 工 授 精3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1供 体 牛 d o n o r提 供 卵 子 和 胚 胎 的 优 秀 繁 殖 母 牛。3.2受 体 牛 r e c i p i e n t接 受 胚 胎（移 植）的 母 牛。3.3同 期
14、 发 情 s y n c h r o n o u s e s t r u s使 用 外 源 激 素 来 调 控 一 群 母 牛 的 发 情 进 程，使 之 在 预 定 的 时 间 内 集 中 发 情 和 排 卵。3.4超 数 排 卵（简 称 超 排）s u p e r o v u l a t i o n在 母 牛 发 情 周 期 的 适 当 时 间，使 用 外 源 性 腺 激 素，诱 导 更 多 的 卵 泡 正 常 发 育，并 多 排 卵。3.5胚 胎 冷 冻 保 存 e m b r y o c r y o p r e s e r v a t i o n按 胚 胎 冷 冻 的 原 理 和 方
15、法，对 胚 胎 进 行 冷 冻，并 在 液 氮 中 长 期 保 存。3.6胚 胎 移 植 e m b r y o t r a n s f e r将 受 精 卵（胚 胎）移 植 到 受 体 母 牛 子 宫 角 内。4 胚 胎 移 植 的 要 求D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 22供 体 牛 和 受 体 牛 应 为 同 一 属 种，供 体 牛 和 受 体 牛 的 发 情 时 间 相 差 不 应 超 过 2 4 h，且 从 供 体 牛 输 卵 管内 收 集 到 的 胚 胎 应 移 植 到 受 体 牛 的 输 卵 管 内，从 供 体 牛 子 宫 角 内 收 集 到 的 胚 胎 应 移
16、植 到 受 体 牛 的 子 宫 角内。5 供 体 牛 的 选 择 与 饲 养 管 理5.1 供 体 牛 的 选 择符 合 云 岭 牛 的 典 型 特 征，系 谱 清 楚，遗 传 性 能 稳 定，种 用 价 值 高，健 康、体 质 健 壮、膘 情 中 等。性周 期 正 常，生 殖 机 能 好。年 龄 1 4 月 龄 到 1 0 岁,体 重 2 8 0 k g 6 0 0 k g。经 产 母 牛 产 后 6 0 天 以 上，生 殖 机 能恢 复 正 常。5.2 供 体 牛 的 饲 养 管 理保 持 环 境 卫 生、避 免 各 种 应 激、分 群 饲 养、专 人 管 理、加 强 蛋 白 营 养、注
17、重 补 充 青 绿 饲 料、优 质 青干 草、维 生 素 和 微 量 元 素，保 持 营 养 平 衡。6 供 体 牛 的 超 排 及 输 精6.1 超 排 处 理6.1.1 超 排 激 素F S H（促 卵 泡 素）、P G（前 列 腺 素 及 其 类 似 物）、C I D R或 C U E-M A T ET M（孕 酮 阴 道 栓）、G n R H（促 性 腺 激 素 释 放 激 素）、L H（促 黄 体 生 成 素）等。6.1.2 超 排 方 法6.1.2.1 F S H+P G 法在 发 情 周 期 的 任 一 天 对 供 体 牛 用 一 次 P G 法 进 行 同 期 发 情 处 理
18、或 选 择 自 然 发 情 的 供 体 牛 在 发 情 周 期的 第 1 0 天 1 1 天 开 始 采 用 递 减 法 每 天 早、晚 各 注 射 一 次 F S H，连 续 注 射 4 天，在 注 射 F S H 的 第 3 天 注 射 P G。6.1.2.2 C I D R或 C U E-M A T ET M+F S H+P G 法以 供 体 牛 发 情 当 日 为 0 天，在 第（6 1）天 置 入 C I D R或 C U E-M A T ET M，第 1 0 天 1 1 天 开 始 注 射 F S H，连 续 注 射 4 天，第 1 2 天 1 3 天（F S H 注 射 第 3
19、天）注 射 P G，同 时 取 出 C I D R或 C U E-M A T ET M。6.1.2.3 F S H 和 P G 用 量6.1.2.1 和 6.1.2.2 中 F S H 和 P G 用 量 可 采 用 下 列 任 意 一 种 组 合：日 本 产 F S H 2 4 m g 3 6 m g+美 国 产 P G 3 0 m g 3 5 m g 或 国 产 氯 前 列 烯 醇 0.6 m g 0.8 m g；加 拿 大 产 F S H 3 2 0 m g 3 8 0 m g+美 国 产 P G 3 0 m g 3 5 m g 或 国 产 氯 前 列 烯 醇 0.6 m g 0.8 m
20、 g；国 产 F S H 1 0 m g 1 2 m g+国 产 氯 前 列 烯 醇 0.6 m g 0.8 m g。6.2 发 情 鉴 定在 注 射 P G 2 4 h 后 进 行 发 情 鉴 定，发 情 鉴 定 方 法 按 D B 5 3/T 2 4 7.3 的 规 定 执 行。6.3 冻 精 质 量 检 查D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 23应 符 合 G B 4 1 4 3 的 规 定。6.4 输 精注 射 P G 后 4 8 h 采 用 直 肠 把 握 输 精 法 进 行 第 一 次 输 精，间 隔 1 2 h 进 行 第 二 次 输 精，输 精 方 法 按 D B
21、5 3/T4 4 7.3 的 规 定 执 行。在 第 一 次 输 精 时 注 射 G n R H 或 其 类 似 物 5 0 g 1 0 0 g 或 在 第 一 次 输 精 时 注 射 L H 2 0 0 0I U 3 0 0 0 I U。7 胚 胎 回 收（冲 胚）7.1 冲 胚 时 间供 体 牛 以 超 排 发 情 后 第 一 次 输 精 当 日 为 0 天，在 第（7 0.5）天，用 非 手 术 法 回 收 胚 胎。7.2 冲 胚 前 的 准 备7.2.1 主 要 器 材冲 胚 管 及 内 芯、子 宫 颈 扩 张 棒、子 宫 颈 黏 液 吸 除 器、过 滤 式 集 卵（胚）杯、Y 字 型
22、 三 通 硅 胶 管，以及 5 0 m L 注 射 器、2 0 m L 注 射 器、1 0 m L 注 射 器、5 m L 注 射 器、培 养 皿、量 筒、毛 剪、镊 子 等。7.2.2 药 剂新 洁 尔 灭、2%利 多 卡 因、0.9%生 理 盐 水、酒 精、青 霉 素、链 霉 素 等。7.2.3 冲 胚 液 的 配 制基 液：杜 氏 磷 酸 缓 冲 液（P B S），配 方 见 附 录 A。也 可 用 进 口 P B S 粉 配 制。冲 胚 液：含 1%F C S（胎 犊 血 清）或 C S（犊 牛 血 清）加 含 抗 生 素 的 P B S 液。也 可 直 接 用 进 口 的 冲 胚 液
23、。7.2.4 冲 胚 准 备按 以 下 步 骤 进 行 冲 胚 准 备：a)将 供 体 牛 在 保 定 架 内 站 立 保 定 好，用 2%利 多 卡 因 或 普 鲁 卡 因 3 m L 5 m L 进 行 硬 膜 外 腔 麻 醉；b)将 牛 尾 固 定，清 除 直 肠 中 的 粪 便；c)母 牛 阴 部 先 用 清 水 清 洗，再 用 新 洁 尔 灭 溶 液 清 洗，然 后 用 灭 菌 卫 生 纸 擦 干，最 后 用 酒 精 棉 球消 毒d)用 子 宫 颈 扩 张 棒 扩 张 子 宫 颈 口，再 用 黏 液 吸 除 器 清 除 子 宫 颈 黏 液；e)检 查 冲 胚 管 气 囊 是 否 完
24、好，内 芯 用 冲 胚 液 湿 润 后 插 入 冲 胚 管 并 固 定 好；f)将 冲 胚 管 缓 慢 插 入 到 子 宫 角 前 端；g)用 吸 满 2 0 m L 空 气 的 注 射 器 向 气 囊 内 注 入 空 气，青 年 牛 1 0 m L 1 5 m L，经 产 牛 1 5 m L 1 8 m L；h)确 定 气 囊 是 否 在 子 宫 角 内 理 想 的 位 置，固 定 冲 胚 管；i)抽 出 内 芯，连 接 冲 胚 管 与 Y 字 型 三 通 管；7.2.5 冲 胚按 以 下 步 骤 冲 胚：a)关 闭 三 通 管 输 出 管 开 关，用 5 0 m L 注 射 器 或 自 动
25、 灌 流 仪 每 次 吸 取 1 5 m L 3 0 m L 冲 胚 液 从 输入 管 注 入 子 宫 角；D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 24b)关 闭 输 入 管 开 关，用 直 肠 中 的 手 将 子 宫 角 上 扬 并 进 行 适 度 按 摩，打 开 输 出 管 开 关，使 回 收 液从 输 出 管 流 到 集 收 杯 中；c)每 侧 子 宫 角 冲 洗 6 次 1 0 次，每 侧 子 宫 角 用 2 5 0 m L 3 0 0 m L 冲 胚 液，根 据 供 体 牛 子 宫 角 的大 小，先 少 后 多，逐 渐 增 量；d)一 侧 子 宫 冲 胚 完 毕 后，用 注
26、射 器 筒 接 到 冲 胚 管 的 注 气 口 将 气 囊 中 的 气 体 放 出，抽 出 冲 胚 管；e)用 同 样 的 方 法 对 另 一 侧 子 宫 角 冲 胚；f)两 侧 子 宫 角 冲 胚 完 成 后，冲 胚 管 抽 回 至 子 宫 体，灌 注 抗 菌 素（青 霉 素 2 0 0 万 单 位 链 霉 素 1 0 0万 单 位 溶 液 2 0 m L 5 0 m L）或 其 它 预 防 子 宫 炎 的 药 物，同 时，肌 肉 注 射 P G（氯 前 列 烯 醇 0.4m g 0.6 m g）；g)将 回 收 液 送 回 实 验 室 或 检 胚 室，用 集 卵 漏 斗 过 滤，保 留 1
27、 0 m L 左 右 的 液 体，倒 入 培 养 皿 中，供 镜 检。8 胚 胎 质 量 鉴 定8.1 检 胚8.1.1 在 实 验 室（检 胚 室）内 2 0 2 5 常 温 下，将 盛 有 回 收 液 的 培 养 皿 或 集 卵 杯 置 于 实 体 显 微 镜下 按 图 1 所 示 顺 序 检 胚，重 复 3 遍 4 遍。图 1 检 胚 顺 序8.1.2 检 出 的 胚 胎 及 时 移 放 到 盛 有 含 2 0%犊 牛 血 清（C S）的 P B S 保 存 液 或 T C M-1 9 9 培 养 液 的 培 养 皿 中（同 一 头 供 体 牛 的 胚 胎 放 入 同 一 培 养 皿 中
28、），并 做 好 标 记。8.1.3 胚 胎 用 P B S 保 存 液 或 T C M-1 9 9 培 养 液 清 洗 3 次 5 次，然 后 进 行 胚 胎 质 量 鉴 定。8.2 胚 胎 的 质 量 鉴 定8.2.1 形 态 学 方 法8.2.1.1 观 察在 4 0 倍 8 0 倍 的 实 体 显 微 镜 或 倒 置 显 微 镜 下 观 察 所 回 收 的 胚 胎 受 精 与 否、发 育 状 态、形 态 轮 廓、色 泽、卵 裂 球 的 大 小、均 匀 度、细 胞 密 度、透 明 带 间 隔、变 性 程 度 以 及 胚 胎 本 身 的 发 育 阶 段 是 否 与 胚 胎实 际 日 龄 相
29、一 致 等。8.2.1.2 发 育 期 划 分D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 25供 体 牛 超 排 发 情 后 第（7 1）天 的 胚 胎 发 育 期 划 分 为 以 下 6 个 时 期：早 期 桑 椹 胚（E a r l y M o r u l a，E M），卵 裂 球 隐 约 可 见，内 细 胞 团 基 本 占 满 卵 周 间 隙；致 密 桑 椹 胚（C o m p a c t M o r u l a，C M），卵 裂 球 进 一 步 分 裂 变 小，看 不 清 卵 裂 球 的 界 线，内 细胞 团 致 密 收 缩，占 卵 周 间 隙 的 6 0%7 0%；早 期 囊 胚
30、（E a r l y B l a s t o c y s t，E B），出 现 透 亮 的 囊 胚 腔，开 始 分 为 发 暗 的 内 细 胞 团 和 明 亮 的 滋养 层，但 两 层 界 线 尚 不 明 晰，细 胞 团 占 卵 周 间 隙 的 7 0%8 0%；囊 胚（B l a s t o c y s t，B L），囊 胚 腔 增 大 明 显，内 细 胞 团 和 滋 养 层 细 胞 界 线 清 晰，细 胞 充 满 卵 周间 隙；扩 张 囊 胚（E x p a n d e d B l a s t o c y s t，E x p），囊 胚 腔 充 分 扩 张，体 积 增 至 原 来 的 1.2
31、 1.5 倍，透明 带 变 薄，约 为 原 厚 度 的 1/3；孵 化 囊 胚（H a t c h e d B l a s t o c y s t，H e d 或 H B），囊 胚 腔 扩 张 到 一 定 程 度，透 明 带 破 裂，胚 胎 细胞 团 脱 出 透 明 带。8.2.1.3 发 育 阶 段供 体 牛 排 卵 受 精 后 不 同 时 间 的 胚 胎 发 育 阶 段 见 表 1。表 1 供 体 牛 排 卵 受 精 后 不 同 时 间 的 胚 胎 发 育 阶 段时间（天）0 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 1 0胚胎形态发育阶段1 细胞 2 细胞 4 细胞
32、 8 细胞1 6 细胞早期桑葚胚致密桑葚胚早期囊胚囊胚扩张囊胚孵化囊胚8.2.1.4 胚 胎 质 量 等 级胚 胎 质 量 划 分 为 下 列 四 个 等 级：1 级，即 优 质 胚，胚 胎 发 育 阶 段 正 常、形 态 完 整、轮 廓 清 晰、色 泽 正 常、几 乎 无 水 泡 样 卵 裂 球，没 有 变 性 细 胞；2 级，即 良 质 胚，发 育 阶 段 正 常、形 态 基 本 正 常、完 整、轮 廓 清 楚，但 有 一 部 分 突 出 细 胞 可 见，变 性 部 分 占 1 0%以 下；3 级，即 普 通 胚，发 育 阶 段 正 常、突 出 的 细 胞 或 较 明 显 不 均 匀，变
33、性 部 分 占 1 0%3 0%；4 级，即 不 良 胚，细 胞 不 均 匀、变 性 细 胞 明 显，变 性 部 分 占 3 0%5 0%；发 育 缓 慢 和 未 受 精 卵。8.2.1.5 胚 胎 使 用1 级 3 级 为 正 常 胚 胎，其 中 1 级 2 级 胚 胎 可 供 鲜 胚 移 植 和 冻 胚 保 存。3 级 胚 胎 需 经 培 养，从 形 态判 断 存 活 力 后 决 定 是 否 移 植 或 冷 冻 或 舍 弃。4 级 胚 不 能 使 用。8.2.2 体 外 培 养 法将 被 鉴 定 的 胚 胎 用 T C M-1 9 9 F 1 C S 或 T C M-1 9 9 F C S
34、-M E（-巯 基 乙 醇）培 养 液，在 5%C O2、9 5%空 气、3 8.5、饱 和 湿 度 的 培 养 箱 中 培 养 2 4 h 4 8 h，判 断 胚 胎 是 否 存 活 和 活 力。桑 椹 胚、早 期 囊 胚以 培 养 后 的 扩 张 囊 胚 率 和 孵 化 胚 率 来 衡 量 胚 胎 的 质 量，扩 张 囊 胚 率 和 孵 化 率 高 表 明 胚 胎 质 量 好，形 态 正常 的 胚 胎 经 培 养 后 的 孵 化 率 应 在 7 0%以 上。D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 269 胚 胎 的 冷 冻 保 存 及 解 冻9.1 胚 胎 的 冷 冻 保 存9.1
35、.1 仪 器、器 材实 体 显 微 镜、胚 胎 冷 冻 仪、液 氮 罐、液 氮、细 管、封 口 仪、吸 胚 管、0.2 2 m 过 滤 器、培 养 皿、记号 笔 等。9.1.2 保 存 液 与 冷 冻 液含 有 2 0%犊 牛 血 清(C S)的 P B S 液 为 保 存 液。用 8%乙 二 醇（E G）0.1 m o l/L 海 藻 糖（T r e.）m-P B S 2 0%C S,用 0.2 2 m 滤 器 过 滤 灭 菌 分 装 为 冷 冻 液。9.1.3 胚 胎 装 管胚 胎 先 在 保 存 液 微 滴 中 清 洗 4 次，然 后 在 冷 冻 液 微 滴 中 清 洗 4 次。将 胚
36、胎 吸 入 0.2 5 m L 细 管 内，用 封口 机 封 口、分 类、标 记，在 4 的 冰 箱 内 放 置 平 衡 1 0 m i n 1 5 m i n 后 放 入 冷 冻 仪。9.1.4 胚 胎 冷 冻 保 存胚 胎 冷 冻 仪 温 度 降 至-7，在-7 保 持 2 m i n 后 进 行 人 工 植 冰，继 续 保 持 至 1 0 m i n，以 0.3/m i n的 速 率 降 温 至-3 0，在-3 0 保 持 1 0 m i n 后，直 接 放 入 盛 有 液 氮 的 液 氮 罐 中 保 存，并 定 期 检 查 和 加 液氮。9.2 胚 胎 解 冻从 液 氮 中 取 出 装
37、 有 胚 胎 的 细 管，空 气 浴 6 s 后 在 3 2 3 5 解 冻 杯 中 水 浴 1 0 s。1 0 胚 胎 移 植1 0.1 受 体 牛 的 选 择供 同 期 发 情 处 理 的 受 体 牛 必 须 是 确 认 空 怀 的。受 体 牛 的 选 择 参 见 附 录 B。1 0.2 受 体 牛 的 饲 养 管 理1 0.2.1 在 移 植 前 7 周 开 始 补 饲，加 强 饲 养 管 理。1 0.2.2 在 移 植 前 5 周，注 射 维 生 A、D、E，补 充 微 量 元 素，如 硒 等。1 0.2.3 保 持 受 体 牛 饲 养 环 境 的 相 对 稳 定 与 卫 生，避 免
38、应 激。1 0.2.4 妊 娠 受 体 牛 在 饲 喂 全 价 日 粮 饲 料 基 础 上，补 充 盐、矿 物 质 和 维 生 素，加 强 舍 外 运 动。1 0.3 受 体 牛 的 同 期 发 情 处 理1 0.3.1 P G F 2 法1 0.3.1.1 一 次 P G F 2 法对 受 体 牛 在 发 情 周 期 的 任 意 一 天（除 发 情 当 日）直 肠 检 查，只 对 卵 巢 上 有 黄 体 的 一 次 注 射 P G F2 或类 似 物（L u t a l y s e或 氯 前 列 烯 醇），在 注 射 P G 后 2 4 h 9 6 h 观 察 发 情。1 0.3.1.2 两
39、 次 P G F 2 法D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 27在 受 体 牛 发 情 周 期 的 任 意 一 天（除 发 情 当 日 外），不 论 卵 巢 上 有 无 黄 体，先 注 射 P G F2 或 类 似 物 一次(L u t a l y s e 或 氯 前 列 烯 醇)，间 隔 1 1 天 1 4 天 再 用 等 量 注 射 一 次，在 第 二 次 注 射 P G 后 2 4 h 9 6 h 内观 察 发 情。1 0.3.2 C I D R（C U E-M A T ET M）P G F 2 法在 受 体 牛 发 情 周 期 的 任 一 天（除 发 情 当 日），无 论
40、卵 巢 上 有 无 黄 体，将 C I D R（C U E-M A T ET M）孕 酮阴 道 栓 置 入 阴 道 内，以 置 栓 之 日 为 0 天，在 第 7 天 一 次 性 肌 注 P G F2 类 似 物（氯 前 列 烯 醇），第 9 天 取 出C I D R（C U E-M A T ET M），或 在 第 8 天 撤 栓 的 同 时 注 射 氯 前 列 烯 醇，第 1 0 天 1 2 天（取 栓 后 7 2 h 内）或 第 9 天 1 0 天 观 察 发 情。1 0.3.3 E B+C I D R（C U E-M A T ET M）P G F 2 法在 受 体 牛 发 情 周 期 的
41、 任 一 天，将 C I D R（C U E-M A T ET M）置 入 阴 道 内，同 时 肌 肉 注 射 E B（E s t r a d i o lB e n z o a t e，E B，苯 甲 酸 雌 二 醇)。第 8 天 撤 栓,同 时 肌 注 氯 前 列 烯 醇；第 9 天 再 次 注 射 E B，不 观 察 发 情，在 第 1 6 天 1 7 天 检 查 黄 体 状 况。1 0.3.4 G n R H+P G F 2 法对 受 体 牛 不 作 黄 体 检 查，第 1 天 注 射 G n R H 或 类 似 物（F e r t a g y）或 促 排 3 号（L H R H-A 3
42、），第 7 天 肌注 P G F2（L u t a l y s e或 氯 前 列 烯 醇），第 9 天 再 次 肌 注 同 等 量 的 G n R H。不 观 察 发 情，在 第 1 6 天 检 查 黄 体状 况。1 0.4 受 体 牛 的 发 情 鉴 定同 供 体 牛 发 情 鉴 定。1 0.5 受 体 牛 的 胚 胎 移 植1 0.5.1 器 具、药 剂解 冻 杯、移 植 枪、移 植 枪 塑 料 外 套 和 保 护 膜、毛 剪、2%利 多 卡 因、酒 精 棉 球、5 m L 一 次 性 注 射 器、无 菌 纸、生 理 盐 水 棉 球。1 0.5.2 移 植 时 间根 据 发 情 记 录 和
43、 移 植 前 黄 体 检 查 结 果，判 定 供 体（胚 龄）与 受 体 牛 的 发 情 日 之 差，最 终 确 定 移 植 时间。受 体 与 供 体 发 情 时 间 宜 同 步，如 不 能 同 步，二 者 发 情 时 间 差 应 小 于 2 4 h，特 别 是 移 植 体 内 受 精 鲜 胚时（见 表 2）。表 2 受 体 牛 胚 胎 移 植 时 间受体与 供体的发情时间相差（h）-2 4 0+2 4站 立发情时间早 移植 移植 移植晚 移植 移植 不移植1 0.5.3 黄 体 判 定D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 28胚 胎 移 植 前 一 天 或 移 植 当 天，对 发
44、情 正 常 的 受 体 牛 进 行 直 肠 检 查，根 据 黄 体 的 大 小、弹 性、突 出 状况 确 定 是 否 合 格，只 对 黄 体 合 格（A、B 级）而 且 黄 体 所 处 的 时 期 与 胚 龄 一 致 的 受 体 牛 移 植。云 岭 牛 及 其他 品 种 受 体 牛 胚 胎 移 植 时（发 情 第 7 1 天）的 黄 体 级 别 判 断 参 见 附 录 C。1 0.5.4 胚 胎 移 植 操 作1 0.5.4.1 细 管 装 枪鲜 胚 装 管 或 冻 胚 按 9.2 进 行 解 冻，用 消 毒 纸 擦 干 细 管，再 用 半 干 的 酒 精 棉 球 擦 拭 细 管 表 面，剪
45、开 细管 封 口 端(如 用 细 管 塞 封 口 的 则 拔 出 即 可)，细 管 棉 塞 端 装 入 移 植 枪 中，套 上 灭 菌 的 保 护 外 套 和 保 护 膜。1 0.5.4.2 胚 胎 移 植受 体 牛 保 定 好 后 清 洗 和 消 毒 受 体 牛 外 阴 部。用 2%利 多 卡 因 进 行 硬 膜 外 腔 麻 醉。采 用 非 手 术 法 把 胚 胎移 植 到 黄 体 合 格 侧 子 宫 角 内。要 求 在 解 冻 后 1 0 m i n 内 完 成 移 植。1 0.5.5 移 植 记 录填 写 胚 胎 移 植 记 录 表，内 容 包 括 受 体 牛 号、发 情 日 期、黄 体
46、 位 置（左 或 右 侧 卵 巢）、黄 体 级 别（A、B、C 级）、供 体 牛 号 以 及 移 植 日 期、移 植 者、备 注（如 出 血、子 宫 内 膜 炎 和 其 它）等。1 1 受 体 牛 的 妊 娠 诊 断受 体 牛 胚 胎 移 植 后 第 2 5 天 3 0 天，用 B 超 作 早 期 妊 娠 诊 断，第 6 0 天 8 0 天 用 直 肠 检 查，确 定 妊 娠与 否。诊 断 方 法 按 D B 5 3/T 4 4 7.3 的 规 定 执 行。D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 29附 录 A（规 范 性）杜 氏 磷 酸 缓 冲 液 配 方 表杜 氏 磷 酸 缓 冲
47、液 配 方 见 表 A.1。表 A.1 杜 氏 磷 酸 缓 冲 液 配 方 表试剂名称 量N a C l 8.0 0 gK C l 0.2 0 gN a2H P O4（N a2H P O4 1 2 H2）1.1 5(2.1 6）gK H2P O40.2 0 gC a C l2（C a C l2 2 H2O）0.1 0(0.1 3 2）gM g C l2（M g C l2 6 H2O）0.1(0.2 1 3 3）g丙酮酸钠 0.3 6 g葡萄糖（葡萄糖 H2O）1.0 0(1.1 0）g青霉素 0.0 7 5 g链霉素 0.0 5 g酚红 0.0 0 5 g超纯净水 1 LD B 5 3/T 4
48、 4 7.4 2 0 2 21 0附 录 B（规 范 性）受 体 牛 选 择受 体 牛 选 择 见 表 B.1。表 B.1 受 体 牛 选 择牛品种 受体选择标准云岭牛健康，年龄 2 8 岁，胎次 1 6；体格较大，膘情中等，体重 3 0 0 k g 以上；空怀或产后 6 0 天以上，性周期正常，发情表现良好；泌乳性能好。奶牛健 康，年龄 1.5 岁 8 岁，胎 次 0 5；体格 较大，膘 情中 等，体重 3 5 0 k g 以 上；空怀 或产 后 9 0 天 以上，性周期正常，发情表现良好。纯种肉牛或杂交牛健康，年龄 2 岁8 岁，胎次 1 6；体格较大，膘情中等，体重 3 0 0 k g
49、以上；空怀或产后 6 0 天以上，性周期正常，发情表现良好；泌乳性能好。云南黄牛健康，年龄 3 岁8 岁，胎次 1 5；体格较大，膘情中上，体重 2 5 0 k g 以上；空怀或产后 6 0 天以上，性周期正常，发情表现良好；后躯发育良好，泌乳性能好。注：屡配不孕、习惯性流产或难产，肢 体疾病、过肥或过瘦的不能作为受体。D B 5 3/T 4 4 7.4 2 0 2 21 1附 录 C（规 范 性）受 体 牛 发 情 第（7 1）天 黄 体 选 择受 体 牛 发 情 第（7 1）天 黄 体 选 择 见 表 C.1。表 C.1 受 体 牛 发 情 第（7 1）天 黄 体 选 择牛品种 黄体判定参
50、考标准云岭牛A 级：黄体明显突出卵巢表面，顶部有冠状开口，直径约 1.5 c m，弹性好。B 级：黄体突出卵巢表面，直径 约 1.0 c m，弹性适中。C 级：黄 体突 出不 明显，直径 1.0 c m，硬、弹性 差；直 径 1.0 c m，但突 出不 明显 或 不突 出，质 地 过软，弹性差。奶牛A 级：黄体明显突出卵巢表面，顶部有冠状开口（呈火山口样），直径约 2.0 c m，弹性好。B 级：黄体突出卵巢表面，直径 约 1.5 c m，弹性适中。C 级：黄 体不 突出，直 径 1.0 c m，硬、弹性 差；直 径 1.0 c m，但突 出不 明显 或 不突 出，质地 过软，弹性差。纯种肉牛
