1、 ICS 65.150 CCS B 52 DB51 四川省地方标准 DB51/T 2913 2022 大口黑鲈 诺卡氏菌 病诊断和 防治技术 规程 Specification for diagnosis and control of Pathogen Nocardiosis from Micropterus salmoides 2022-05-20 发布 2022-07-01 实施 四川省市场监督管理局 发 布 DB51/T 2913 2022 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 试 剂和 材料.1 5 设 备和 仪器.2 6 临 床
2、检 查.2 7 实 验室 样品 采集.2 8 细 菌的 分离 与培 养.2 9 细 菌的 鉴定.2 10 结 果判 定.4 11 综 合判 定.5 12 防 治方 法.5 附录A（规 范性）培养 基和试 剂配 制方 法.6 附录B（资 料性）16S rDNA 基 因参 考序 列（GeneBank 登 录号：JCM3360）.7 DB51/T 2913 2022 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。本文件 由四 川省 农业 农村 厅提出、归 口并 解释。本文件 起草 单位：成 都农 业科技 职业
3、学院、四 川农 业大学、内 江师 范学 院。本文件 主要 起草 人：李成 伟、耿 毅、王均、贺 扬、吴宏伟、刘 海燕、王 振华、李建 臻、黎丽。本文件 首次 发布。DB51/T 2913 2022 1 大 口黑鲈 诺卡氏菌 病诊断 和防治技 术规程 1 范围 本文件 规定了 大口黑 鲈（Micropterus salmoides）养殖过 程中发 生的诺 卡氏 菌病的 流行情 况、发病症状、诺 卡氏 菌的 分离 培养、形态 学鉴 定、生 理 生化鉴 定、16S rRNA 基 因 鉴定、特异 性鉴 定及 其防 治等技术 规程。本文件 适用 于大 口黑 鲈诺 卡氏菌 病的 诊断 和防 治。2 规范性
4、 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分析 实验 室用 水规格 和试 验方 法 GB/T 14926.43 实验 动物 细菌学 检测 染 色法、培 养 基和试 剂 GB/T 27623.1 渔用 抗菌 药 物药效 试验 技术 规范 NY 5051 无 公害 食品 淡 水 养殖用 水水 质标 准 SC/T 1132 渔药 使用 规范 SC/T 7014
5、 水生 动物 检疫 实验室 技术 规范 SC/T 7103 水生 动物 产地 检疫采 样技 术规 范 DB51/T 526 大 口黑 鲈养 殖 技术规 范 食用 鱼 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 大口黑 鲈诺 卡氏 菌病 nocardiosis of largemouth bass 指由鰤 诺卡 氏菌（Nocardia seriolae）感 染大 口黑 鲈引起 的一 种细 菌性 传染 病。4 试剂和 材料 水 4.1 用水符 合GB/T 6682-2008 中一级 水规 格。试剂与 培养 基 4.2 革兰氏 染液配 制按照GB/T 14926.43 中 的规定
6、 执行，牛脑心 浸液培 养基（BHI）、50TAE 缓 冲液、1%琼脂 糖凝胶、七 叶苷培 养基、明胶培 养基 等相关 配方见 附录A，细菌 基因 组DNA提取 试剂 盒、PCR纯化试剂盒 选用 专业 试剂 公司 提供的 商品 化试 剂盒。DB51/T 2913 2022 2 16S rRNA 扩增 引物 4.3 16S rRNA 基 因 序 列 扩 增 引 物，27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。特异性 鉴定 引物 4.4 特 异 性 鉴 定 上 游 引 物 N5F1：5-TGAGCCTGAACTGCATGGT
7、TC-3，下 游 引 物 N5R1：5-ACGGTATCGCAGCCCTCTGTA-3。5 设备和 仪器 超净工 作台、光学 显微镜、PCR仪、电 泳仪、离心 机、生化 培养箱、恒 温摇床 培养箱、常规 细菌 接种器械（包 括培 养皿、酒 精灯、接种 环、酒精 棉等）、4/-20 冰箱 等。6 临床检 查 流行情 况 6.1 水温15 32 时都 可 流行，我省在 每年4 月底 开 始大规 模爆发，直 至10月 均有该 病流行，25 28为 发病 高峰 期，死亡 率高。临床和 解剖 症状 6.2 患病鱼 反应 迟钝、离 群独 游，食 欲下 降，主要 病变 为体表 出现 溃疡 灶以 及出 血点，
8、在鳃 丝、躯 干 皮下脂肪、肌 肉、腹腔（包 括 肝、肾、脾、鱼 鳔、肠 系膜）出现乳 白色 或黄 色结 节，结节大 小通 常直 径 0.5 3mm，肝脏 肿大、淤 血，鱼 鳔腔内 有积 液等。7 实验室 样品 采集 样品采 集按SC/T 7013 中 的 规定执 行。8 细菌的 分离 与培 养 用75%酒精 棉球 对样 品体 表 进行擦 拭消 毒后，无 菌操 作 取肝脏、头 肾、中肾 和脾 脏 进行病 原菌 分离。利用接 种环，划线 接种至BHI 固体 培养基，28 恒温 培养箱 培养7 12d，从形 态一致 的优势 菌群 中挑 取单个菌 落进 一步 纯化 培养。9 细菌的 鉴定 形态学 鉴
9、定 9.1 9.1.1 菌落形 态 分离病 原菌 在BHI 固 体培 养 基28 培养712d 后 观察 菌落形 态。9.1.2 细菌形 态 DB51/T 2913 2022 3 革兰氏 染色 法染 色观 察，参照GB/T 14926.43 中的 规 定执行。生化特 性鉴 定 9.2 9.2.1 氧化酶 试验 按SC/T 7014 中 的规 定执 行，菌落 呈玫 瑰红 色，然后 变为深 紫色 者为 阳性。9.2.2 尿素酶 试验 按SC/T 7014 中 的规 定执 行，红色 为阳 性。9.2.3 硝酸盐 还原 试验 按SC/T 7014 中 的规 定执 行，红色 为阳 性。9.2.4 过氧化
10、 氢酶 试验 挑取单 个菌 落，置于 洁净 的载玻 片上，加 入3%过氧 化氢1 2滴，观 察有 无气 泡产生，有 气泡 产 生 者为阳性。9.2.5 柠檬酸 盐试 验 按SC/T 7014 中 的规 定执 行，培养 基蓝 色为 阳性。9.2.6 七叶苷 水解 试验 将待检 菌接 种于 七叶 苷培 养基，28 培养7 12d，培养基 变为 黑色 为阳 性，不变色 者为 阴性。9.2.7 明胶液 化试 验 将待检 菌种 接种 于明 胶培 养基，28 培养7 12d，明胶液 化者 为阳 性。9.2.8 淀粉水 解试 验 按SC/T 7014 中 的规 定执 行，呈蓝 色者 为阴 性，无蓝 色者为
11、阳性。16S rRNA 鉴定 9.3 9.3.1 总DNA 提取 DNA 提 取采 用商 品化 的细 菌 基因组DNA 提取 试剂 盒，按 说明书 操作。9.3.2 16S rRNA 基因 序列 扩增 将上述 提取DNA 作为 模板，利用“4.3”中 的引 物扩 增16S rRNA 序 列，反 应在25 L体 系中 进行：PCR Premix 12.5 L，上下 游 引物各1.0 L，2.0 L模板DNA，双蒸 水补 足至25L。反应 条件：95 预变 性5min；95 变 性30s，55 退火30s，72 延伸1.5min，循 环扩 增30 次；72 终延 伸10min。4 保存 备用。空白
12、对 照取 等体 积的 双蒸 水代替DNA 模板。9.3.3 琼脂糖 凝胶 电泳 用1TAE 电泳 缓冲 液配制1%的琼脂 糖凝 胶（含0.5L/mLEB）平板，凝 固后放 入 水平电 泳槽，使泳缓冲液 刚好淹 没胶 面。将 上述扩 增产物6L 样品加 入样品 孔，使 用DNA 分子 量 标准参 照物作 对照。120VDB51/T 2913 2022 4 电泳约15 30min，当指 示 剂到达 底部时 停止。于紫 外光下 观察电 泳条 带，在 长波紫 外灯下 用刀 片切 下含有目 的条 带（约1500bp）的胶 块，放入 无菌 离心 管中称 重。9.3.4 PCR 扩 增产 物纯 化 将 上述
13、 琼脂 糖凝 胶电 泳产物，使 用PCR纯化 试 剂 盒进行 纯化DNA，按 说明 书 操作。9.3.5 测序与 同源 性分 析 将上述 提取 的DNA 进 行测 序，并与 参考 序列（附 录B）进行比 对分 析。特异性 检测 9.4 9.4.1 特异性 基因 扩增 将“9.3.1”中提 取DNA 作 为模板，利 用“4.4”中 的 引物扩 增，进行 特异 性PCR 检测，同时 设置 阳性和阴性 对照。反应 在25 L 体系中 进行，反应 条件：94 预变 性4min；94 变 性1min，58 退火30s，72 延伸1.5min，循 环扩 增30 次；72 终 延伸10min。9.4.2 序
14、列检 测 PCR 产 物于1%的 琼脂 糖凝 胶 电泳进 行检 测，观察 片段 大小。10 结果判 定 菌落形 态 10.1 沙粒状 淡黄 色菌 落，粗糙 易碎，边缘 不整 齐，在表 面形成 褶皱。细菌形 态 10.2 革兰氏 染色 呈阳 性，镜检 可见菌 体紫 色分 枝状。生理生 化特 性 10.3 生理生 化反 应试 验结 果见 表1。表1 诺卡氏 菌生 理生 化特 性 检测项目 参照结果 检测项目 参照结果 七叶苷水解+过氧化氢酶+明胶液化-氧化酶-淀粉水解-脲素酶-硝酸盐还原-柠檬酸盐+注：“+”表示阳性，“-”表 示阴性 16S rRNA 基因 序列 检测 10.4 预计扩 增片 段
15、为1500bp，测 定的16S rRNA 基 因序 列与 附录B 所列 的基 因序 列比 较，同源 性达98%以上。DB51/T 2913 2022 5 特异性 检测 10.5 预计扩 增片 段为1069 bp。PCR 产物 于1%的琼 脂糖 凝胶 电泳进 行检 测，在1000bp 条带处 得到 预期 大 小的单一 明亮 条带，同 时阳 性对照 条带 明亮，阴 性对 照无条 带，判定 为阳 性。11 综合判 定 符合以 下a）b）c）三条 特 征的 基 础上，d）或 者e）特征出 现任意 一条 者判定 为大口 黑鲈诺 卡氏 菌病。a)患病大 口黑 鲈流 行情 况和 发病症 状与“6.1”和“6
16、.2”相 符；b)所分离 病原 菌菌 落与 菌体 形态分 别与“10.1”和“10.2”相符；c)生理生 化反 应结 果与“表1”相 符；d)16S rRNA 基因 序列 与附 录B 所列 的基 因序 列同 源性 分析结 果 达 98%以上；e)分离菌 株DNA 特 异性 基因 检测阳 性。12 防治方 法 预防方 法 12.1 放苗前 做好清 塘工 作，使 用无诺 卡氏菌 污染 的水源 和水系 统，养 殖用 水符合NY 5051 中的规 定；购入 的 大 口黑 鲈 苗 种经 检 验检 疫 合 格，不 含 诺卡 氏 菌病 原；做好 投 饲 及日 常 管理 工 作，参 照DB51/T 526中的
17、规 定执 行；在 该病 高 发期，可 选用 聚维 酮碘 或 戊二醛 溶液 等渔 用消 毒药 物全池 泼洒 预防，按照 商 品说明使 用。治疗方 法 12.2 参照GB/T 27623.1 中 的规定 筛选敏 感抗 生素药 物，使 用敏感 抗生 素和维 生素C进 行拌料 内服，外用聚 维酮 碘或 戊二 醛溶 液等渔 用消 毒药 物全 池泼 洒，药 物使 用应 符合SC/T 1132 的 要求。DB51/T 2913 2022 6 A A 附录A（规范 性）培养基 和试 剂配 制方 法 A.1 BHI 牛 脑心 浸液 固体 培养 基 在800ml 双 蒸水 中加 入37g BHI 牛 脑心 浸液，
18、15 20g 琼脂粉，混匀，加 热搅拌 溶解，调节pH 值为7.40.2，定 容至1000ml，121 高 压灭 菌15min。A.2 50 TAE 缓 冲液 在400mL 双蒸 水中溶 解121g Tris 碱，加入28.55mL 冰 乙酸和50mL 0.5mol/L EDTA。再加 双蒸水 定容至500mL，室温 保存。使 用 时，配 成1 TAE 电泳 缓冲 液。A.3 1%琼脂 糖凝 胶 琼脂糖1g中 加入1xTAE缓冲液100mL，加热 溶解 后，加 入5L Goldenview 混匀。A.4 七叶苷 培养 基 胰蛋白胨5.0g，磷 酸 二氢钾1.0g，七叶 苷3.0g，柠檬 酸 铁
19、 铵0.5g，混 匀，加热 搅 拌 溶 解，调节pH值为7.4 0.2，定容 至1000ml，121 高压 灭菌15min。A.5 明胶培 养基 NaCI 5g，蛋 白胨10g，牛 肉 膏3g，明胶120g，混匀，加热搅 拌溶 解，调节pH 值为7.4 0.2，定 容至1000ml，121 高压 灭菌15min。DB51/T 2913 2022 7 B B 附录B（资料 性）16S rDNA 基因 参考 序列（GeneBank 登录 号：JCM3360）1 ttaacacatg caagtcgagc ggtaaggccc ttcggggtac acgagcggcg aacgggtgag 61
20、taacacgtgg gtgatctgcc ttgcactctg ggataagcct gggaaactgg gtctaatacc 121 ggatatgagc ctgaactgca tggttcgggt tggaaagatt tatcggtgcg agatgggccc 181 gcggcctatc agcttgttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc 241 tgagagggcg accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 301 agtggggaat attgcacaa
21、t gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac 361 ggccttcggg ttgtaaacct ctttcgacag ggacgaagcg caagtgacgg tacctgtaga 421 agaagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttgtc 481 cggaatgact gggcgtaaag agcttgtagg cggtctgtca cgtcggtcgt gaaaactcac 541 agctcaactg tgggcctgcg gtcgatacgg gcagact
22、aga gtacttcagg ggagactgga 601 attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcggg 661 tctctgggaa gtaactgacg ctgagaagcg aaagcgtggg tagcgaacag gattagatac 721 cctggtagtc cacgccgtaa acggtgggta ctaggtgtgg gtttccttcc acgggatccg 781 tgccgtagct aacgcattaa gtaccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaa
23、actca 841 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg gattaattcg atgcaacgcg 901 aagaacctta cctgggtttg acatacaccg gaaagccgta gagatacggc ccccccttgt 961 ggtcggtgta caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag 1021 tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcttatg ttgccagcgc gtaatggcgg ggactcgtga 1081 gagactgc
24、cg gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta 1141 tgtccagggc ttcacacatg ctacaatggc cggtacagag ggctgcgata ccgtgaggtg 1201 gagcgaatcc cttaaagccg gtctcagttc ggatcggggt ctgcaactcg accccgtgaa 1261 gttggagtcg ctagtaatcg cagatcagca acgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1321 tacacaccgc ccgtcacgtc atgaaagtcg gtaacacccg aagccggtgg cctaaccctt 1381 gtggagggag ccgtcgaagg tgggattggc gattggg
