1、 ICS 65.150 CCS B 52 四 川 省 地 方 标 准 DB51 DB51/T 2910 2022 鲟鱼类志 贺邻单胞 菌病诊断 技术规程 Technical specification for the diagnosis of Plesiomonas shigelloides for sturgeon 2022-05-20 发布 2022-07-01 实施 四 川 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB51/T 2910-2022 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范 性引 用文 件.1 3 术语 和定 义.1 4 试剂 和材 料.1 5 设备 与器 械.2 6 临
2、床 检查.2 7 实验 室样 品采 集.2 8 细菌 分离 与纯 化.2 9 细菌 鉴定.2 10 结 果判 定.4 11 综 合判 定.4 附录 A（规 范性）试 剂 配方.5 附录 B（资 料性）类 志贺 邻单胞 菌 16S rRNA 基因 参 考序列.6 DB51/T 2910-2022 II 前言 文件按 照 GB/T 1.1 2020 标准 化工作 导则 第 1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规定起草。本文件 由四 川省 农业 农村 厅提出、归 口并 解释。本文件 起草 单位：四 川省 农业科 学院 水产 研究 所。本文件 主要 起草 人：刘亚、龚全、赖 见生、吴 晓雲
3、、陈叶 雨、宋明 江、杜军、刘光 迅、周剑。本文件 及其 所代 替文 件的 历次版 本发 布情 况为：本 次为 首次 发布。DB51/T 29102022 1 鲟 鱼类志 贺邻单胞 菌病诊 断技术规 程 1 范围 本文件 规定 了鲟 鱼类 志贺 邻单胞 菌病 诊断 的术 语和 定义、试剂 和材 料、设备 和器材、临 床检 查、实验室样 品采 集、细菌 分离 与纯化、细 菌鉴 定、结果 判定和 综合 判定 等技 术规 程。本文件适 用于达 氏鲟（Acipenser dabryanus）和 西 伯利亚鲟（Acipenser baerii）的 类志贺 邻单胞菌（Plesiomonas shigell
4、oides）的诊 断。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不 可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 4789.28-2013 食品 安全国 家标 准 食品 微生 物 学检验 培 养基 和试 剂的 质 量要求 GB/T 6682-2008 分 析实 验 室用水 规格 和实 验方 法 GB/T 18652-2002 致 病性 嗜水气 单胞 菌检 验方 法 SC/T 7013-2008 水 生
5、动 物 产地检 疫采 样技 术规 范 SC/T 7014-2006 水 生动 物 检疫实 验技 术规 范 SC/T 7201.1-2006 鱼类 细 菌病检 疫技 术规 程 第 1 部分：通用 技术 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 鲟鱼类 志贺 邻单 胞菌 病 Plesiomonas shigelloides for sturgeon 指由类 志贺 邻单 胞菌（Plesiomonas shigelloides）感染引 起达 氏鲟 和西 伯利 亚鲟发 病或 死亡 的一种细菌 性疾 病。4 试剂和 材料 4.1 试剂、染 色液 和培 养 基 检验中所 需试 剂、染
6、色液 与培养基 的配 制按照 GB/T 4789.28、GB/T 18652 和 SC/T 7014 规定 执行，Taq 酶、dNTPs、10 PCR 缓冲 液（无Mg2+），DNA 分子量 标准 参照 物选用 专 业试剂 公司 提供 的商品 化试剂；微生 物生 化鉴 定管 可替代 相应 鉴定 培养 基或 鉴定试 剂，上述 未提 及的 见附录A。4.2 水 应符合GB/T 6682 中 一级 水 的规格。4.3 引物 16S rRNA 基因DNA 序 列 扩 增 引 物，P-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，P-R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，-20 保
7、 存。DB51/T 29102022 2 5 设备与 器械 超净工 作台、高 压灭 菌锅、恒温 培养 箱、高 速冷 冻 离心机、水 平电 泳系 统、凝胶成 像系 统、普通 光学显微 镜、PCR 扩增 仪、电 子天平、微量 移液 器、普 通冰箱、解剖 盘、剪刀、镊子、手术刀、培 养皿、铂耳丝、酒 精灯 等。6 临床检 查 6.1 临床 症状 病鱼共 同特 征为 反应 迟钝，离群 独游，游 动迟 缓或 侧翻，摄食 减少 或停 止摄 食。6.2 体表 检查 体表外 部检 查参 照 SC/T 7201.1 中 6.2 执行。病 鱼 鳍条基 部不 同程 度的 充血、出血；部 分病 鱼腹部膨大；极 少病
8、鱼 无 明显 外部病 变。6.3 剖检 肝脏肿 大充 血，出血；部 分病鱼 肠道 肠腔 内有 少量 淡黄色 的粘 液，部分 病鱼 肠道无 明显 的变 化。7 实验室 样品 采集 样品采 集按 SC/T 7013 执 行。8 细菌分 离与 纯化 在无菌 的环 境中，用 灭菌 铂耳分 别勾 取病 鱼的 肝、肾，划 线接 种至LB固 体培 养基，28 培 育24-48小时，从中 挑取 圆形、隆 起、光 滑、边缘 整齐 的单 个菌落 在LB 平板 上进 行纯 化培养。LB 培养 基的 配 制 方法见附 录A.1。9 细菌鉴 定 9.1 革兰 氏染 色 参考 GB/T 18652-2002 中 2.2.
9、5 规 定执 行。9.2 生理 生化 试验 采用细 菌生 化鉴 定管 进行 试验，也可 利用 全自 动细 菌鉴定 仪鉴 定。9.2.1 乙酰 甲基 甲醇（V-P）试验 按 SC/T 7014 中表 2 的 规定执 行。有气 泡产 生为 阳性；无气 泡产 生为 阴性。9.2.2 氧化 酶试 验 以毛细 管吸 取四 甲基 对二 苯胺的 1%水溶 液滴 在细 菌的菌 落上。菌 落呈 玫瑰 红色、深紫 色为 阳性，不变色 为阴 性。DB51/T 29102022 3 9.2.3 吲哚 试验 按 SC/T 7014 表 2 的吲 哚（靛 基质）试 验的 规定 执行。培养 基变 红为 阳性；不变 红为 阴
10、性。9.2.4 糖、醇类（葡 萄糖、甘露 醇）发酵 试验 将待检 菌穿刺 接种 于糖、醇类发 酵试验 培养 基（A.2），28 培 养 24 h后观 察。培 养基变 黄色 为阳性，不变 黄色 为阴 性。9.2.5 运动 性试 验 按 GB/T 4789.28 中 2.8 的方法 配制 半固 体 培 养基。把待 检菌 穿刺 接种 于半 固体 培 养基，28 培养 36 h-48 h。若待 检菌 由 穿刺线 向四 周扩 散，其边 缘呈云 雾状，为 运动 性阳 性；若 待检 菌只 生长 在穿刺线上，边 缘十 分清 晰，为运动 性阴 性。9.3 16S rRNA 基因 序列 测 定与同 源性 分析 9
11、.3.1 细菌 基因 组DNA 抽提 酚氯仿 法、高盐 法或 采用 商用试 剂盒 提取 细菌 基因 组DNA。9.3.2 16S rRNA 基 因扩 增 PCR 反 应体 系：10 P CR 缓 冲液（无Mg2+）5.0 L，MgCl2（25 mmol/L）5.0 L，dNTPs（10 mmol/L）1.0 L，引物(20 mo l/L)P-F 和P-R各1.0 L，Taq DNA酶（5 U/L）0.5 L，DNA 模板1.0 L，无菌双 蒸水补 足至50 L。混匀 后，3000 r/min 离心30s。设空 白对照，空 白 对照取 等体积 的双蒸 水代替DNA 模板。PCR 反应 条件：94
12、 预变 性 5 min；94 变 性 1 min，54 退 火 1 min，72 延伸 1 min，35次循环；72 延伸 10 min；4 保 温。9.3.3 琼脂 糖凝 胶电 泳 用TAE电 泳缓 冲液（A.3）配制 1 的琼 脂糖 平板，凝固后 放入水 平电 泳槽，使电泳 缓冲液 刚好 淹没胶面。将 上述 6 L 样 品和 2 L 溴酚 蓝指 示剂 溶液（A.4）混 合后 加入 样 品孔，使用DNA 分子 量标 准参照物 作对照。120 V电泳约 20 min-40 min，当 溴 酚蓝到 达底部 时停 止。于 紫外光 下观察，并 在长波紫外灯 下用 刀片 切下 含目 的条带（约1500
13、 bp）的 胶 块，放 入无 菌离 心管 中称 重。9.3.4 PCR 扩增 产物 纯化、测序、序 列比 对 9.3.4.1 PCR 扩 增产 物纯 化 按每 0.1 g 琼脂 糖凝 胶加 0.1 mL 酚，将 酚加 入 9.3.3 含 有目 的条 带胶 块的 离心管 中。经漩 涡 震荡仪震 荡1 min-2 min，将 离心管 在-70 放置1h，使凝胶 完全 冻结。37 水 浴将冻 结的 凝胶 融化 后，在漩涡 震荡 仪上 震荡 1 min-2 min；14000 r/min 离心 5 min。取上 层水 相转 入另一 个离 心管 中，加入等体积 的酚：氯 仿：异戊 醇（25 24 1）（
14、A.5），混匀，12000 r/min 离心 5 min。取上 清液 加 入 等体积的 氯仿：异 戊醇（24:1）（A.6），混 匀，12000 r/min 离心 5 min。向收 集的水 溶液 中加 入 1/10 体积的 3 mol/L 的 乙酸 钠 和2倍 体积 的无 水乙 醇，置-20 过 夜或-70 放 置 1 h-2 h。14000 r/min 离心 10 min，弃上 清。将 沉淀的DNA 溶于 适当 体积 的TE缓冲 液中，置-20 保 存，待 测。9.3.4.2 PCR 扩 增产 物测 序与同 源性 分析 将上述 纯化 的PCR 扩 增产 物 进行序 列测 定，并与 参考 序列
15、（附录B）进行 比对 分 析。DB51/T 29102022 4 10 结果判 定 10.1 菌落 形态 28 培养 24 h-48 h，形 成圆形、隆 起、光滑、边 缘整齐 的菌 落。10.2 细菌 染色 革兰氏 染色 为阴 性短 杆菌。10.3 生理 生化 试验 生理生 化反 应试 验结 果见 表 1。表1 类志 贺邻 单胞 菌的 生 理生化 反应 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 氧化酶+甘露醇-V-P-吲哚+葡萄糖+运动性+注：“+”为阳性，“-”为阴 性 10.4 16S rRNA 基因 序列 测定与 同源 性分 析 测定的 16S rRNA 基 因序 列 与附录
16、B所 列的 基因 序列 比 较，同 源性 达 98%以上。11 综合判 定 符合以 下所 有特 征者 判定 为 类志 贺邻 单胞 菌 病 a)临 床症 状与 6 相 符；b)菌 落形 态和 染色 观察 与 10.1 和 10.2 相符；c)生 理生 化反 应结 果与 10.3 相 符；d)16S rRNA 基 因序 列同 源性分 析结 果与 10.4 相 符。DB51/T 29102022 5 附 录 A（规范 性）试剂配 方 A.1 LB 固 体培 养基 胰蛋白 胨 10 g 酵母提 取物 5 g NaCl 5 g 琼脂或 者琼 脂糖 15 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.0-7.2，
17、115 灭 菌 20 min。A.2 糖、醇 类发 酵培 养基 蛋白胨 2 g NaCl 5 g K2HPO4 0.2 g 被测糖 或醇 类 10 g 琼脂 6g 溴百里 酚蓝 1 水 溶液 3 mL（溴 百里 酚蓝先 用少量 95 乙醇溶 解后，再加 水配制 1 的水 溶液）蒸馏水 1000 mL pH 7.0-7.2，分 装试 管，培养基 高度 约 4.5 cm，115 灭 菌 20 min。A.3 50 TAE 电 泳缓 冲液 在 800 mL双 蒸水中 溶解 242 g Tris 碱，加入57.1 mL 冰乙酸 和 37.2 g EDTA，充分混 匀后，加双蒸水定 容至 1 L，室 温
18、保 存。使 用时，配 成1 TAE 电泳缓 冲液。A.4 溴 酚蓝 指示 剂溶 液 6 上样 缓冲 液 将溴酚 蓝 100 mg，加双 蒸 水 5 mL，在 室温下 过夜。待溶解 后再称 取蔗 糖 25 g，加双 蒸水溶 解后移入溴 酚蓝 溶液 中，摇匀 后定容 至 50 mL，加 入NaOH 溶液 1 滴，调 至蓝 色。A.5 酚：氯 仿：异戊 醇（25:24:1）将 25 体积 的酚、24 体 积 的氯仿 和 1 体 积的 异戊 醇 混合即 可，室 温贮 存于 不 透光的 瓶中，上面 加上TE 缓 冲液，4 保 存。A.6 氯 仿：异戊 醇（24:1）将 24 体积 的氯 仿和 1 体 积
19、的异 戊醇 混合 即可，室 温贮存 于不 透光 的瓶 中。DB51/T 29102022 6 附 录 B（资料 性）类志贺 邻单 胞菌16S rRNA 基因参 考序 列 AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCC
20、GCCCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTA
21、AACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACAGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGA
22、CTCTAGCTTGCCAGTTTCAAATGCAGTTCCCAAGTTGAGCTCGGGGATTTCACATCTGACTTAACAAACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCGAGTAACGTCAATGCCACTAGGTATTAACTAGTGACCCTTCCTCCCCGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCAC
23、TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGGTCATTCTCTCAAACCAGTTAGAGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCCACCTGGGTTCATCCGATAGCATGAGGTCCGAAGAGCCCCCACTTTGGTCCGTAGACATTATGCGGTATTAGCTACAGTTTCCCGTAGTTATCCCCCTCTATCGGGCAGATCCCCAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTCGTCACCCAAGGAGCAAGCTCCTCTGTGTTACCGCTCGACTTGC
