1、I C S 1 1.2 2 0C C S B 4 1DB50重 庆 市 地 方 标 准D B 5 0/T 1 2 5 4 2 0 2 2山 羊 地 方 性 鼻 内 肿 瘤 病 毒 E v a G r e e n 荧 光定 量 P C R 检 测 方 法2 0 2 2-0 6-0 1 发 布 2 0 2 2-0 9-0 1 实 施重 庆 市 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 5 0/T 1 2 5 4 2 0 2 2I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草
2、。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 重 庆 市 农 业 农 村 委 员 会 提 出 并 归 口。本 文 件 起 草 单 位：重 庆 市 畜 牧 科 学 院、西 南 大 学、重 庆 市 酉 阳 土 家 族 苗 族 自 治 县 畜 牧 产 业 发 展 中 心。本 文 件 主 要 起 草 人：陈 静、叶 超、方 仁 东、何 玮、徐 远 东、范 彦、黄 德 均、赵 金 红、孙 晓 燕、黎 年富。D B 5 0/T 1 2 5 4 2 0 2 21山 羊 地 方 性 鼻 内 肿 瘤
3、病 毒 E v a G r e e n 荧 光定 量 P C R 检 测 方 法1 范 围本 文 件 规 定 了 山 羊 地 方 性 鼻 内 肿 瘤 病 毒 E v a G r e e n 荧 光 定 量 P C R 检 测 方 法 的 缩 略 语、原 理、试 剂 和耗 材、仪 器 和 设 备、样 品 采 集、运 输 与 保 存、操 作 步 骤、结 果 判 定、实 验 室 生 物 安 全 要 求 等 内 容。本 文 件 适 用 于 山 羊 地 方 性 鼻 内 肿 瘤 病 毒 核 酸 的 检 测。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 引 用 而
4、 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B 1 9 4 8 9 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求G B/T 2 2 9 1 5 口 蹄 疫 病 毒 荧 光 R T-P C R 检 测 方 法N Y/T 5 4 1 兽 医 诊 断 样 品 采 集、保 存 与 运 输 技 术 规 范3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义。4
5、缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件。c D N A 互 补 脱 氧 核 糖 核 酸（c o m p l e m e n t a r y D N A）C t 值 每 个 反 应 管 内 的 荧 光 信 号 达 到 设 定 的 阈 值 时 所 经 历 的 循 环 数（C y c l e t h r e s h o l d）D E P C 焦 碳 酸 二 乙 酯（d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e）E N T V-2 山 羊 地 方 性 鼻 内 肿 瘤 病 毒（E n z o o t i c n a s a l t u m o r v i
6、 r u s 2 o f g o a t s）g D N A 基 因 组 D N A（g e n o m i c D N A）g D N a s e 基 因 组 脱 氧 核 糖 核 酸 酶（G e n o m i c d e o x y r i b o n u c l e a s e）P B S 磷 酸 盐 缓 冲 液（P h o s p h a t e B u f f e r e d S o l u t i o n）P C R 聚 合 酶 链 式 反 应（P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n）q P C R 荧 光 定 量 P C R（Q
7、 u a n t i t a t i v e P C R）R N A 核 糖 核 酸（R i b o n u c l e i c A c i d）5 原 理D B 5 0/T 1 2 5 4 2 0 2 22根 据 山 羊 地 方 性 鼻 内 肿 瘤 病 毒 基 因 特 定 的 序 列 设 计 合 成 一 对 特 异 性 引 物，该 对 引 物 能 针 对 E N T V-2目 的 基 因 进 行 扩 增，产 生 双 链 D N A 片 段，在 q P C R 反 应 体 系 中 加 入 的 E v a G r e e n 荧 光 染 料 能 与 双 链 D N A片 段 结 合 而 产 生
8、荧 光 信 号，通 过 检 测 P C R 反 应 液 中 的 荧 光 信 号 强 弱，实 现 对 目 的 基 因 的 准 确 定 量。随着 P C R 反 应 的 循 环 进 行，P C R 产 物 与 荧 光 信 号 的 增 长 呈 现 对 应 关 系。6 试 剂 和 耗 材6.1 除 特 别 说 明 外，本 文 件 所 用 试 剂 均 为 分 析 纯，所 有 试 剂 均 用 无 R N A 酶 污 染 的 容 器（用 D E P C 水处 理 后 高 压 灭 菌）分 装。6.2 R N A 提 取 试 剂：T r i z o l、三 氯 甲 烷、异 丙 醇、无 水 乙 醇、D E P C
9、 水，或 其 他 同 等 效 果 的 商 品 化 试剂 盒。6.3 反 转 录 试 剂：5 g D N A B u f f e r（含 g D N a s e）、F Q-R T P r i m e r M i x、F a s t K i n g R T E n z y m e M i x、1 0 K i n gR T B u f f e r；或 其 他 同 等 效 果 的 商 品 化 试 剂 盒。6.4 反 应 液：E v a G r e e n 荧 光 定 量 P C R 反 应 液。6.5 特 异 性 引 物：E N T V-2-F：G A G G C A A A T T G A G G
10、C G T T G A T；E N T V-2-R：C C C G T T C T G C A T T C G-C T G T A G（靶 序 列 见 附 录 A）。6.6 阴 性 对 照：D E P C 水。6.7 阳 性 对 照：质 粒 p M D-1 9 T-E N T V-2。6.8 P B S 溶 液：按 照 G B/T 2 2 9 1 5 中 P B S 溶 液 配 制 的 规 定 执 行。6.9 1.5 m L 离 心 管（无 R N A 酶）。6.1 0 0.2 m L P C R 管。6.1 1 医 用 棉 签。7 仪 器 和 设 备7.1 荧 光 定 量 P C R 仪。7
11、.2 高 速 冷 冻 离 心 机。7.3 恒 温 水 浴 锅。7.4 超 净 工 作 台。7.5 生 物 安 全 柜（A 2 级）。7.6 微 量 可 调 移 液 器（2.5 L，1 0 L，1 0 0 L，1 m L）及 配 套 带 滤 芯 吸 头。7.7 超 低 温 冰 箱。7.8 常 规 冰 箱。7.9 制 冰 机。7.1 0 瞬 时 离 心 机。7.1 1 涡 旋 振 荡 仪。8 样 品 采 集、运 输 与 保 存8.1 采 集 与 运 输样 品 采 集 及 运 输 按 照 N Y/T 5 4 1 的 规 定 执 行。山 羊 鼻 腔 内 有 鼻 液 的 直 接 用 医 用 棉 签 采
12、集，无 鼻 液的 用 蘸 有 P B S 溶 液 的 医 用 棉 签 采 集，拭 子 放 入 1.5 m L 离 心 管 内，做 好 标 识，再 将 离 心 管 放 入 塑 料 自 封袋 内，然 后 放 入 装 有 冰 袋 的 保 温 箱，2 4 h 内 运 输 至 实 验 室。D B 5 0/T 1 2 5 4 2 0 2 238.2 保 存按 照 G B/T 2 2 9 1 5 的 规 定 执 行。采 集 或 处 理 好 的 样 品 在 0 4 条 件 下 保 存 不 应 超 过 2 4 h；如需 长 期 保 存，应 置-8 0 冰 箱，避 免 反 复 冻 融。9 操 作 步 骤9.1 样
13、 品 处 理在 生 物 安 全 柜 中，向 装 有 拭 子 的 1.5 m L 离 心 管 中 加 入 灭 菌 P B S 溶 液 0.5 m L，在 涡 旋 振 荡 器 上 振荡 1 5 s，吸 出 全 部 P B S 悬 液 备 用。9.2 病 毒 R N A 的 提 取9.2.1 吸 取 上 述 样 品 处 理 后 的 P B S 悬 液 0.2 m L 置 入 新 的 1.5 m L 离 心 管，加 入 0.7 m L T r i z o l，涡 旋 振荡 1 5 s，室 温 静 置 1 0 m i n。9.2.2 加 入 0.2 m L 三 氯 甲 烷，涡 旋 振 荡 1 5 s，4
14、 1 2,0 0 0 r p m 离 心 1 0 m i n，取 上 清 液。9.2.3 加 入 0.5 m L 的 异 丙 醇 混 匀，4 1 2,0 0 0 r p m 离 心 1 0 m i n，弃 去 上 清 液。9.2.4 加 入 1 m l 7 5%乙 醇，4 1 2,0 0 0 r p m 离 心 1 0 m i n，弃 去 上 清 液。9.2.5 室 温 静 置 干 燥，加 入 2 0 L D E P C 水 溶 解 沉 淀，直 接 用 于 实 验 或 置-8 0 超 低 温 冰 箱 保 存。注：或采用其他同等效果的商品化试剂盒进行R N A 提取。9.3 反 转 录9.3.1
15、 模 板 R N A 应 在 冰 上 解 冻，表 1 和 表 2 中 所 用 试 剂 应 在 室 温 下 解 冻，然 后 使 用 前 分 别 涡 旋 振 荡混 匀，离 心 1 5 s，置 于 冰 上 备 用。9.3.2 基 因 组 D N A（g D N A）去 除 反 应 体 系 的 配 制：在 超 净 工 作 台 中，将 表 1 中 的 试 剂 依 次 加 入 P C R管 中，涡 旋 振 荡 混 匀，离 心 1 5 s，在 恒 温 水 浴 锅 中 4 2 孵 育 3 m i n，作 为 反 转 录 的 R N A 模 板。表 1 g D N A 去 除 反 应 体 系组成成分 使用量（L
16、）5 g D N A B u f f e r（含 g D N a s e）2T o t a l R N A 5D E P C 水 3总体积 1 0表 2 反 转 录 反 应 体 系试剂 使用量（L）1 0 K i n g R T B u f f e r 2F Q-R T P r i m e r M i x 2F a s t K i n g R T E n z y m e M i x 1R N A 模板 1 0D E P C 水 5总体积 2 0D B 5 0/T 1 2 5 4 2 0 2 249.3.3 反 转 录 反 应 体 系 的 配 制：在 超 净 工 作 台 中，将 表 2 中 的
17、试 剂 依 次 加 入 P C R 管 中，涡 旋 振 荡 混 匀，离 心 1 5 s。9.3.4 R N A 样 品 的 反 转 录：4 2 1 5 m i n，9 5 3 m i n，反 应 结 束 后，置 冰 上 冷 却，得 c D N A 用 于 后 续实 验，或 放 入-2 0 冰 箱 中 储 存。9.4 荧 光 定 量 P C R 检 测9.4.1 荧 光 定 量 P C R 反 应 体 系使 用 E v a G r e e n 荧 光 定 量 P C R 反 应 液 S s o F a s t E v a G r e e n S u p e r m i x 进 行 P C R。E
18、 N T V-2-F 和E N T V-2-R 浓 度 均 为 1 0 M，反 应 体 系 具 体 见 表 3。表 3 荧 光 定 量 P C R 反 应 体 系试剂使用量检测样品 阳性对照 阴性对照S s o F a s t E v a G r e e n S u p e r m i x 1 0 L 1 0 L 1 0 LE N T V-2-F 0.4 L 0.4 L 0.4 LE N T V-2-R 0.4 L 0.4 L 0.4 Lc D N A 1 L p M D-1 9 T-E N T V-2 1 L D E P C 水 补足至 2 0 L9.4.2 荧 光 定 量 P C R 反
19、应 条 件预 变 性 9 5 2 m i n；变 性 9 5 5 s，6 0 3 0 s（收 集 信 号），共 4 0 个 循 环；熔 解 曲 线 条 件：9 5 1 5 s、6 0 1 5 s、9 5 1 5 s。注：或采用其他同等效果的 E v a G r e e n 荧光定量 P C R 反应液商品化试剂进行。1 0 结 果 判 定1 0.1 质 控 标 准阴 性 对 照 无Ct 值，无 特 异 性 扩 增 曲 线，无 熔 解 峰；阳 性 对 照Ct 值 应 2 8.0，有 特 异 性 扩 增 曲 线，熔解 曲 线 只 在 8 2 有 一 个 熔 解 峰，实 验 成 立，否 则，实 验
20、无 效。1 0.2 结 果 描 述 及 判 定1 0.2.1 阴 性 结 果无Ct 值，无 特 异 性 的 扩 增 曲 线，无 熔 解 峰，判 定 被 检 样 品 中 山 羊 鼻 内 肿 瘤 病 毒 核 酸 为 阴 性。1 0.2.2 阳 性 结 果Ct 值 小 于 3 5.0，出 现 特 异 性 的 扩 增 曲 线，熔 解 曲 线 只 有 一 个 峰，且 在 8 2，判 定 被 检 样 品 中 山 羊鼻 内 肿 瘤 病 毒 核 酸 为 阳 性。1 0.2.3 可 疑 样 品 判 定D B 5 0/T 1 2 5 4 2 0 2 253 5.0 Ct 值 4 0.0 的 样 品 应 复 检，复
21、 检 的 结 果 仍 为 3 5.0 Ct 值 4 0.0，熔 解 曲 线 只 有 一 个 峰，且 在8 2，判 定 为 阳 性；无Ct 值 者 判 定 为 阴 性。1 1 实 验 室 生 物 安 全 要 求实 验 操 作 应 符 合 G B 1 9 4 8 9 的 规 定，在 生 物 安 全 二 级 及 以 上 实 验 室 进 行 实 验。D B 5 0/T 1 2 5 4 2 0 2 26A A附 录 A（资 料 性）引 物 扩 增 序 列A.1 引 物 扩 增 序 列G A G G C A A A T T G A G G C G T T G A T G C G A C A T G C T T G G A A T G A G G C T C A T G T G C A A C C T C C A G T G A C A C C G A G T A A C A T A C T G AT C A T G C T A T T G T T A T T G C T A C A G C G A A T G C A G A A C G G G_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
