1、I C S 6 5.0 2 0.3 0C C S B 4 1DB50重 庆 市 地 方 标 准D B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 2基于 plo 基因的山羊化脓隐秘杆菌 PCR 检测方法2 0 2 2-0 6-0 1 发 布 2 0 2 2-0 9-0 1 实 施重 庆 市 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 2I目 次前 言.I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 和 定 义.14 缩 略 语.15 原 理.16 试 剂 材 料、仪 器 设 备.27 方 法 步 骤.28 结 果 判 定.49 废 弃 物 处
2、理.1附 录 A（资 料 性）靶 基 因 片 段 序 列 及 引 物 在 靶 基 因 中 的 位 置.2附 录 B（规 范 性）试 剂 的 配 制.3附 录 C（规 范 性）化 脓 隐 秘 杆 菌 p l o 基 因 P C R 产 物 电 泳 判 定 图.4D B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 2I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承
3、担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 重 庆 市 畜 牧 科 学 院 提 出。本 文 件 由 重 庆 市 农 业 农 村 委 员 会 归 口 并 组 织 实 施。本 文 件 起 草 单 位：重 庆 市 畜 牧 科 学 院。本 文 件 主 要 起 草 人：张 素 辉、沈 克 飞、许 国 洋、付 利 芝、徐 登 峰、朱 燕、蒋 雨、周 俊、陈 朝 洪、龙小 飞、冯 刚、邓 小 龙、刘 博。D B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 21基 于 p l o 基 因 的 山 羊 化 脓 隐 秘 杆 菌P C R 检 测 方 法1 范 围本 文 件 规 定 了 基 于 p l o 基 因
4、的 山 羊 化 脓 隐 秘 杆 菌 P C R 检 测 方 法 的 缩 略 语、原 理、试 剂 材 料、仪 器 设 备、方 法 步 骤、结 果 判 定、废 弃 物 处 理 等 要 求。本 文 件 适 用 于 山 羊 化 脓 隐 秘 杆 菌 病 的 P C R 诊 断。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修
5、 改 单）适 用 于 本文 件。G B/T 6 6 8 2 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法G B 1 9 4 8 9 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求N Y/T 5 4 1 兽 医 诊 断 样 品 采 集、保 存 与 运 输 技 术 规 范S N/T 3 2 2 3 动 物 传 染 病 P C R 检 测 技 术 确 认 规 范3 术 语 和 定 义本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件。D N A 脱 氧 核 糖 核 酸（D e o x y r i b o N u c l e i
6、c A c i d）P C R 聚 合 酶 链 式 反 应（P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n）P L 0 溶 血 素（P y o l y s i n）T S A 胰 酪 大 豆 胨 琼 脂 培 养 基（T r y p t i c S o y A g a r s o y b e a n-c a s e i n d i g e s t a g a r）T S B 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基（T r y p t i c S o y B r o t h s o y b e a n-c a s e i n d i g e s t m
7、e d i u m）5 原 理5.1 本 文 件 针 对 山 羊 化 脓 隐 秘 杆 菌 的 p l o 基 因，设 计 合 成 特 异 引 物，提 取 细 菌 D N A 作 为 模 板，在 D N A 聚 合酶 的 作 用 下，经 高 温 变 性、低 温 退 火 和 中 温 延 伸 的 多 次 循 环，使 特 异 D N A 片 段 的 拷 贝 数 放 大 数 百 万 倍。将 扩 增 的 D N A 片 段 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测，凝 胶 成 像 仪 观 察，可 见 阳 性 条 带。5.2 该 检 测 方 法，只 能 从 化 脓 隐 秘 杆 菌 基 因 组 D N A 中
8、扩 增 出 特 异 条 带。D B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 226 试 剂 材 料、仪 器 设 备6.1 试 剂 材 料实 验 用 水 均 符 合 G B/T 6 6 8 2 二 级 水 规 定。除 另 有 规 定 外，所 用 试 剂 均 为 分 析 纯 及 以 下 的 试 剂:a)化 脓 隐 秘 杆 菌 标 准 菌 株，编 号 A T C C 4 9 6 9 8。b)细 菌 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒：商 品 化 试 剂 盒。c)无 水 乙 醇。d)2 T a q P C R M a s t e r M i x。e)核 酸 染 料。f)D N A 上 样 缓
9、冲 液。g)琼 脂 糖。h)D N A 分 子 量 标 记：D N A M a r k e r 2 0 0 0。i)特 异 性 引 物：p l o-F：T T G A T A A C G G T C C A C C A C G G;p l o-R：C A C T G C C A C G A C C T A C A A G T。靶 基 因 片 段 序列 及 引 物 在 靶 基 因 中 的 位 置 见 附 录 A。j)离 心 管、透 明 薄 壁 P C R 管（0.2 m L）、医 用 棉 签、解 剖 器 械（手 术 刀、剪 刀、镊 子）、样 品 袋。k)T S A 固 体 培 养 基、T S B
10、 液 体 培 养 基、T A E 电 泳 缓 冲 液，配 制 方 法 见 附 录 B。6.2 仪 器 设 备根 据 实 验 需 要，仪 器 设 备 应 符 合 以 下 要 求：a)电 子 天 平（感 量 0.0 0 1 g）。l)高 压 灭 菌 锅（温 度 范 围：1 0 5 1 3 5，工 作 压 力：0.3 5 M P a）。m)高 速 离 心 机（可 控 温 至 4、离 心 速 度 可 达 1 2 0 0 0 r/m i n 以 上）。n)电 热 恒 温 鼓 风 干 燥 箱（温 控 范 围：1 0 3 0 0，恒 温 波 动 度 1）。o)二 级 生 物 安 全 柜。p)恒 温 培 养
11、箱（温 度 范 围：5 5 0，温 度 均 匀 度：1）。q)纯 水 仪。r)组 织 研 磨 仪。s)制 冰 机。t)恒 温 水 浴 锅（温 度 范 围：5 5 0，温 度 均 匀 度：1）。u)4 冰 箱（温 控 范 围：2 8）；-2 0 冰 箱。v)P C R 仪。w)电 泳 仪（电 压 9 0 V 1 2 0 V）。x)凝 胶 成 像 仪。y)微 量 移 液 器（2 L，2 0 L，2 0 0 L，1 0 0 0 L）及 配 套 吸 头。7 方 法 步 骤7.1 样 品 采 集 与 保 存采 样 原 则，按 照 N Y/T 5 4 1 的 规 定 执 行。D B 5 0/T 1 2 4
12、 4 2 0 2 237.1.1 样 品 采 集根 据 临 床 情 况，可 以 采 集 以 下 样 品：a)组 织 样：无 菌 采 集 肺 脏、淋 巴 结 病 变 部 位，将 其 放 入 密 闭 的 样 品 袋 内，并 应 做 好 样 品 标 识。b)胸 腔 积 液：若 有 胸 腔 积 液，在 完 全 暴 露 胸 腔 前，用 2 m L 或 5 m L 注 射 器 无 菌 吸 取 1 m L 2 m L胸 腔 积 液,分 装 于 1.5 m L 离 心 管 中，并 应 做 好 样 品 标 识。c)脓 液：若 有 肩 前 或 股 前 淋 巴 结 肿 大、化 脓，在 脓 肿 部 位 表 面 常 规
13、 碘 酊 消 毒，灭 菌 手 术 刀 在 脓 肿下 部 划 开 小 于 1 c m 创 口，挤 出 脓 液，用 去 掉 针 头 的 5 m L 注 射 器 吸 取 脓 液,分 装 于 1.5 m L 离 心管 中，并 应 做 好 标 识。7.1.2 样 品 保 存应 将 采 集 的 样 品 于 4 条 件 下 保 存，立 即 送 到 实 验 室。7.2 样 品 处 理7.2.1 实 验 环 境实 验 操 作 应 符 合 G B 1 9 4 8 9 要 求，在 二 级 生 物 安 全 实 验 室 进 行。7.2.2 组 织 样 处 理肺 脏、淋 巴 结 等 组 织 样 处 理 方 法 如 下：a
14、）取 4 g 5 g 组 织 样，剪 碎、研 磨，用 5 m L 灭 菌 超 纯 水 混 悬；b）2 0 0 0 r/m i n 离 心 2 m i n，取 上 清 液；c）1 0 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n，弃 上 清 液；d）沉 淀 以 2 0 0 L 超 纯 水 重 悬，备 用。7.2.3 胸 腔 积 液、脓 液 处 理胸 腔 积 液、脓 液 等 样 品 处 理 方 法 如 下：a）无 菌 吸 取 5 0 0 L 胸 腔 积 液 或 脓 液 至 1.5 m L 灭 菌 离 心 管 中，加 入 5 0 0 L 超 纯 水，震 荡 混 匀；b）1 0 0 0 0
15、r/m i n 离 心 1 0 m i n，弃 上 清，收 集 沉 淀；c）沉 淀 以 2 0 0 L 超 纯 水 超 纯 水 重 悬，备 用。7.2.4 可 疑 培 养 物 样 品 处 理取 待 检 液 体 培 养 物（纯 培 养 物 或 混 合 培 养 物）1 m L 1 0 0 0 0 r/m i n 离 心 5 m i n，弃 上 清，沉 淀 以 2 0 0 L 超 纯 水 重 悬，备 用。7.2.5 阳 性 对 照化 脓 隐 秘 杆 菌 标 准 菌 株 经 T S A 复 苏，纯 化 培 养 后 转 接 T S B 培 养，作 为 阳 性 对 照，处 理 应 同 7.2.4。7.2.
16、6 阴 性 对 照灭 菌 超 纯 水，处 理 应 同 7.2.4。7.3 D N A 提 取D B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 24取 第 7.2 获 得 样 品，采 用 同 等 商 品 化 试 剂 盒 进 行 D N A 提 取。7.4 P C R 扩 增7.4.1 基 本 要 求P C R 检 测 过 程 中 的 敏 感 性、特 异 性、重 复 性 等 应 符 合 S N/T 3 2 2 3 要 求。7.4.2 P C R 反 应 体 系 组 成将 提 取 的 D N A 模 板 进 行 P C R 扩 增，阴 性 对 照 为 超 纯 水，P C R 反 应 体 系 2 0 L
17、，反 应 体 系 见 表 1。表 1 P C R 反 应 体 系组份 体积/L2 T a q M a s t e r P C R M i x 1 0 Lp l o-F（1 0 m o l/L）0.5 Lp l o-R（1 0 m o l/L）0.5 LD N A 模板 1 L超纯水 8 L总体积 2 0 L7.4.3 P C R 反 应 程 序9 4 2 m i n；9 4 3 0 s，6 0 3 0 s，7 2 1 5 s，3 0 个 循 环；7 2 3 m i n；4 保 存。7.4.4 P C R 产 物 检 测取 P C R 产 物 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳，方 法 操 作
18、如 下：a)参 照 附 录 B 制 备 5 0 T A E 电 泳 缓 冲 液，稀 释 为 1 T A E 使 用；b)配 制 含 核 酸 染 料 的 1.2%琼 脂 糖 凝 胶；c)取 5 L P C R 扩 增 产 物 与 6 D N A 上 样 缓 冲 液 按 体 积 比 5:1 混 合 后 加 入 加 样 孔；d)用 1 T A E 缓 冲 液 作 为 电 泳 液，在 恒 压 1 2 0 V 下 进 行 电 泳；e)电 泳 3 0 m i n 后 将 凝 胶 取 出，置 于 凝 胶 成 像 仪 中，观 察 P C R 结 果。8 结 果 判 定8.1 检 测 结 果 成 立 条 件D
19、B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 21阳 性 对 照 P C R 产 物 经 电 泳 后 在 2 6 4 b p 出 现 目 的 条 带，阴 性 对 照 P C R 产 物 电 泳 后 没 有 条 带；检 测 结果 成 立。判 定 图 见 附 录 C。8.2 结 果 描 述 及 判 定8.2.1 在 检 测 结 果 成 立 的 前 提 下，如 果 检 测 样 品 中 P C R 产 物 经 电 泳 后 在 2 6 4 b p 的 位 置 上 出 现 一 条 特异 性 条 带，判 为 阳 性，即 该 样 品 为 化 脓 隐 秘 杆 菌 核 酸 阳 性。8.2.2 在 检 测 结 果 成
20、 立 的 前 提 下，如 果 检 测 样 品 中 P C R 产 物 经 电 泳 后 在 2 6 4 b p 的 位 置 上 未 出 现 一 条特 异 性 条 带，判 为 阴 性，即 该 样 品 为 化 脓 隐 秘 杆 菌 核 酸 阴 性。8.2.3 如 果 阳 性 对 照 无 相 应 的 目 的 条 带，可 能 是 存 在 操 作 失 误，该 检 测 需 要 重 新 进 行；如 果 阴 性 对 照有 相 应 的 目 的 条 带，可 能 是 阴 性 对 照 存 在 污 染 或 是 操 作 失 误，该 检 测 需 要 重 新 进 行。9 废 弃 物 处 理检 测 过 程 中 的 废 弃 物，应
21、做 好 无 害 化 处 理，应 符 合 G B 1 9 4 8 9 的 要 求。D B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 22A A附 录 A（资 料 性）靶 基 因 片 段 序 列 及 引 物 在 靶 基 因 中 的 位 置化 脓 隐 秘 杆 菌 p l o 基 因 D N A 片 段 序 列 及 引 物 在 靶 基 因 中 的 位 置 见 图 A.1。图 A.1 靶 基 因 片 段 序 列 及 引 物 在 靶 基 因 中 的 位 置D B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 23B B附 录 B（规 范 性）试 剂 的 配 制B.1 T S A 固 体 培 养 基（1 L）称 取
22、 本 品 4 0.0 g 于 1 L 蒸 馏 水 中，微 温 溶 解，1 2 1 高 压 灭 菌 1 5 m i n；取 出 凉 至 5 5，无 菌 条 件，按 8%比 例 加 入 小 牛 血 清，轻 摇 混 匀 后 制 备 平 板，3 7 培 养 箱 中 培 养 2 4 h，观 察 有 无 菌 落，无 细 菌 生 长即 可 备 用。B.2 T S B 液 体 培 养 基（1 L）称 取 本 品 3 0.0 g 于 1 L 蒸 馏 水 中，微 温 溶 解，1 2 1 高 压 灭 菌 1 5 m i n；取 出 凉 至 5 5，无 菌 条 件，按 8%比 例 加 入 小 牛 血 清，混 匀 后
23、分 装，备 用。B.3 T A E 电 泳 缓 冲 液（p H 约 8.5）的 配 制称 取 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷（T r i s 碱）2 4 2 g，乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠（N a 2 E D T A）3 7.2 g，加 超 纯 水 约 8 0 0 m L充 分 搅 拌 溶 解 后，加 入 5 7.1 m L 醋 酸 充 分 混 匀，最 后 定 容 至 1 L。室 温 保 存。使 用 前，用 超 纯 水 将 5 0 T A E 电 泳 缓 冲 储 存 液 5 0 倍 稀 释 即 可。D B 5 0/T 1 2 4 4 2 0 2 24C C附 录 C（规 范 性）化 脓 隐 秘 杆 菌 p l o 基 因 P C R 产 物 电 泳 判 定 图化 脓 隐 秘 杆 菌 p l o 基 因 P C R 扩 增 产 物 电 泳 图 见 图 C.1。标 引 序 号 说 明：M D N A M a r k e r 2 0 0 0；1 阳 性；2 阴 性。图 C.1 化 脓 隐 秘 杆 菌 p l o 基 因 P C R 产 物 电 泳 判 定_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
