1、Technical regulations for polysaccharide of Sanghuangporus produced in liquid fermentation桑黄多糖液体发酵生产技术规程发 布 湖南省市场监督管理局 2022-05 发 布-0643湖南省地方标准ICSCCS 67.080B 31DB43/T2324 2022 2022-08 实 施-06DB43/T 2324 2022 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规 范性 引用 文件 1 3 术 语和 定义 1 4 发 酵工 艺 1 5 粗 多糖 的提 取 3 6 多 糖的 纯化 3 7 多 糖含 量的 测定 4
2、 8 档 案管 理 4 附录A（资 料性）常用 摇瓶种 培养 基配 方 5 附录B（资 料性）桑黄 液体发 酵培 养基 配方 6 附录C（资 料性）桑黄 多糖液 体发 酵生 产档 案 7 DB43/T 2324 2022 II DB43/T 2324 2022 III 前 言 本文件 按 照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标 准化 文件 的结 构和起 草规 则 的规定起草。请注意 本文 件的 某 些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提出。本文件 由湖 南农 业标 准化 技术委 员会 归口
3、。本文件 起草 单位：湖 南省 微生物 研究 院、湖南 湘蕈 生物科 技有 限公 司。本文件 主要 起草 人：唐 少 军、喻桃 生、许 隽、雷平、邵晨霞、胡浩、贺月 林、吴胜莲、靳磊、杨祎。DB43/T 2324 2022 IV DB43/T 2324 2022 1 桑黄多糖 液体发 酵生产技 术规程 1 范围 本文件 规定 桑黄 多糖 液体 发酵生 产的 发酵 工艺、粗 多糖的 提取、多糖 的纯 化、含 量测 定和 档案 管理等规范。本文件 适用 于桑 黄多 糖的 液体发 酵生 产。2 规 范性 引用 文件 下列文 件 中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的
4、 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 5749 生活 饮用 水卫 生 标准 GB/T 12728 食 用菌 术语 NY/T 528 食用 菌菌 种生 产技术 规程 NY/T 1676 食 用菌 中粗 多 糖含量 的测 定 NY/T 1731 食 用菌 菌种 良 好作业 规范 DB37/T 3995 松花 粉多 糖 实验室 提取 技术 规程 3 术 语和 定义 GB/T 12728 界 定的 以及 下 列术语 和定 义适 用 于 本文 件。3.1 桑黄多 糖
5、sanghuangporus polysaccharide 桑黄多 糖是 从桑 黄中 提取 的一类 真菌 多糖，是桑 黄 的主要 活性 成分，能够 提 高人体 的免 疫力、抗肿瘤等多 种生 物活 性。4 发 酵工 艺 4.1 工艺 流程 母 种 摇瓶 种 发 酵 罐检查 清 洗与 空 灭 投 料与定 容 灭菌 冷却 接种 发 酵 培养 粗多 糖的提取 多 糖的 纯化 多 糖含量 的测 定 4.2 母种 制备 母种制 备应 符 合NY/T 528 的要求。4.3 摇瓶 种制 备 4.3.1 培 养基 DB43/T 2324 2022 2 原料应 符 合NY/T 1935 的 规定，参照 附 录A
6、 配制。4.3.2 装 液量 采用1000 mL 的 常规 三角 瓶，每 瓶装 液量 为 200 mL 300 mL，用八 层纱 布和 牛皮纸 封口。4.3.3 灭菌 在 121 126，0.14 MPa 0.16 MPa 的 压力 下，保 持 25 min。4.3.4 接种 将灭菌 后的 培养 基冷 却至 30 以下，无 菌条 件下 用 打孔法（10 mm 孔径）将 菌丝块 接种 到液 体摇瓶培养 基上，按 每100 mL 液体培 养基 接 种3 个菌 丝 块。4.3.5 培养 接种后 移至 摇床，于 26，130 r/min 条件 下培 养 10 天 4.4 发酵 罐清 洗 4.4.1 检
7、查 罐上全 部阀 门、安全 阀、压力表 等要 求完 好，工作 正常。4.4.2 清洗 流水清 洗罐 体内 外，达到 无死角、内 壁无 任何 培养 料残余 物的 洁净 程度。4.5 发酵 罐空 灭 空罐灭 菌，应在 压 力 0.14 Mpa 0.16 Mpa、温 度 121 126 下 持续 灭 菌40 min。4.6 培养 基配 制 材料应 符 合NY/T 1935 的 规定，参照 附 录A 规 定配 制。4.7 装液 量 发酵罐 总体 积 的60 70。4.8 灭菌 用夹层 预热 培养 基 至 80 后，蒸汽 进罐 升温 至 121 126，0.14 MPa 0.16 MPa 保 压恒 温4
8、0 min。4.9 冷却 培养基 冷却 至26 28。4.10 接种 按常规 接种 方式 接种，接 种量 为 10（V/V）。4.11 发酵 培养 DB43/T 2324 2022 3 罐温为26 28，罐 压为0.02 0.04 MPa，通气 量为10.5 V/V min，搅 拌速度 为130 r/min 160 r/min，培 养时 间为8 10 d。5 粗 多糖 的提 取 5.1 发酵 上清 液收 集 发酵后 的菌 液 在5000 rpm、4 条件 下离 心 15 min，弃去 沉淀，收 集上 清。5.2 除蛋 白 上清液 经旋 转蒸 发浓 缩 10 倍，用Sevag 法 除蛋 白，操作
9、过 程应 符 合DB37/T 3995 的 规定。5.3 沉淀 多糖 将除去 蛋 白 后 的 多 糖 溶 液 缓 慢 加 入 到 4 倍 量 无 水 乙 醇 中，4 条 件 下 静 置 8 h 10 h，然后 在10000 rpm、4 条 件下 离 心 10 min 后收 集底 部沉 淀。5.4 干燥 收集到 的沉 淀经 过冷 冻干 燥后得 到桑 黄粗 多糖。6 多 糖的 纯化 6.1 离子 交换 纯化 6.1.1 层 析柱 填装 将 DEAE-Sepharose Fast Flow 填 料装 填于Column XK 26/40（内 径：26 mm，高度 400 mm）层析 柱中，体 积 为1
10、50 mL，用 Tris-HCl 溶 液（55 mM，pH 7.8 8.0）以 1.5 mL/min 流速过 夜平 衡层 析柱。6.1.2 过 柱分 离 将粗多 糖溶 于Tris-HCl 中，配成 浓度 为10 mg/mL 溶 液，用 0.22 m 滤膜 过滤 后上样。流 动相 使用 Tris-HCl(A)和含 1 M NaCl 的Tris-HCl(B)进行 梯 度洗脱，流 速设 置 为 2.0 mL/min，每 3 min 收集一次洗 脱液。6.2 分子 筛纯 化 6.2.1 层 析柱 填装 将 Sephadex LH-20 装填 于 Column XK 16/100（内 径：16 mm，高
11、 度 1000 mm）层析 柱中，体 积为150 mL，用 Tris-HCl 溶液（55 mM，pH 7.8 8.0）以 0.5 mL/min 流速 过夜 平 衡层析 柱。6.2.2 过 柱分 离 将上一 步纯 化收 集得 到的 多糖组 分溶 于Tris-HCl 中，配成 浓度 为5 mg/mL 溶 液，用0.22 m 滤膜过滤后 上样。流 动相 使用 Tris-HCl 洗 脱液，流 速为 0.5 mL/min，每 10 min 收 集一次 洗脱 液。将得 到的多糖 进行 冷冻 干燥。DB43/T 2324 2022 4 7 多 糖含 量 的 测定 多糖含 量的 测定 应符 合标 准 NY/T
12、 1676 的 规定。8 档 案管 理 生产档 案应 有电 子档 案和 纸质档 案保 存，资料 记录 完整准 确，档案 内容 见附 录 C。档案 记录 一式 2份保存 于生 产基 地和 技术 指导单 位，档案 保 存3 年 以上。DB43/T 2324 2022 5 附 录 A（资料 性）常用摇 瓶种 培养 基配 方 A.1 玉米 粉（或玉 米淀 粉）1，蔗糖 2，蛋 白胨 0.2，酵 母粉 0.3 0.5，磷酸 二氢 钾 0.1，硫酸镁 0.06，pH 值6.0。A.2 葡萄 糖3，豆 饼粉2，玉 米粉1，酵母 粉0.5，磷酸 二氢 钾0.1，碳酸 钙 0.2，硫酸镁0.05，pH 值6.0
13、。玉米 粉，豆 饼粉 均 过 80 目筛。DB43/T 2324 2022 6 附 录 B（资料 性）桑黄液 体发 酵培 养基 配方 B.1 葡萄 糖3.5，酵 母 粉 1，磷 酸二 氢钾 0.15，七 水硫 酸镁 0.01，维生 素 B1 0.01。B.2 豆饼 粉 1，蔗糖 2，磷 酸二 氢钾 0.075，硫酸 镁 0.03。DB43/T 2324 2022 7 附 录 C（资料 性）桑黄多 糖液 体发 酵生 产档 案 表1 桑黄 发酵 生产 多糖 档案 编号：基地名称 联系人 联系电话 地址 所属单位名称 发酵技术情况 培养基 配制 时间 发酵体积 培养基 配方 灭菌条件 记录人 接种 时间 温度 菌种名称 接种量 记录人 发酵培养管理 转速 温度 罐压 通气量 其他情况 记录人：年 月 日
