1、茄子抗青枯病鉴定技术规程Regulation for evaluation of eggplant resistance to Bacterial wilt发 布 湖南省市场监督管理局 2021-02 发 布-20 2021-05 实 施-2043DB43/T2008 2021 湖南省地方标准ICSCCS 65.020B 16DB43/T 20082021 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规 范性 引用 文件 1 3 术 语和 定义 1 4 接 种体 制备 1 5 室 内抗 性鉴 定 2 6 病 情调 查 3 7 抗 病性 评价 4 8 抗 性鉴 定记 载 4 附录A（资 料性）茄子 抗青
2、枯 病鉴 定结 果记 载表 格 5 DB43/T 20082021 II DB43/T 20082021 III 前 言 本文件 按 照 GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第 1 部 分：标准 化文 件的 结 构和起 草规 则 的规定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提出。本文件 由湖 南省 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本文件 起草 单位：湖 南省 蔬菜研 究所。本文件 主要 起草 人：杨建 国、汪 端华、吴 双花、李 倩、王 鑫、皮向 红、宋志 伟。DB43/T
3、 20082021 IV DB43/T 20082021 1 茄子抗青 枯病鉴 定技术规 程 1 范围 本文件 规定 了茄 子青 枯病 鉴定的 术语 和定 义、接种 体制备、室 内抗 性鉴 定、病情调 查、抗病 性评 价以及抗性 鉴 定记 载 等 要求。本文件 适用 于湖 南地 区茄 子青枯 病抗 性鉴 定。2 规 范性 引用 文件 本文件 没有 引用 规范 性文 件。3 术 语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 茄子青 枯病 Bacterial wilt 由茄科 劳尔 氏菌（Ralstonia solanacearum）侵 染引 起 的土传 病害，细 菌性 病害，发病 初
4、期 茄子 个别枝条的 一片 或几 片叶 片局 部萎垂，后症 状逐 渐扩 展 到整株 枝条 上，发 病轻 的 植株白 天萎 蔫，日 落或 早 晨恢复正 常。发病 叶片 初呈 淡绿色，后 变褐 焦枯，病 叶 脱落或 残留 在枝 条上；发 病枝条 髓部 大多 腐烂 空心，维管束 呈黄 色或 褐色，髓 部和皮 层组 织也 变色，用 手挤压 病茎 的横 切面 有乳 白色粘 液渗 出，病 果表 面 正常，内 部变 褐色，后 期病 果呈水 渍状，易 脱落。3.2 病原分 离物 Pathogenic isolate 采用人 工方 法 从 植株 发病 部位分 离获 得病 原物 的纯 培养物。3.3 致病性 Pa
5、thogenicity 病原物 所具 有的 破坏 寄主 植物和 引起 病变 的能 力。3.4 人工接 种 Artificial inoculation 在适宜 条件 下，通过 人工 操作将 接种 体置 于植 物体 的适当 部位 并使 之发 病的 过程。4 接 种体 制备 4.1 病原 物的 分离 与鉴 定 采集自 然发 病的 田间 植株，在超 净工 作台 中，将发 病茎段 在 75 酒精 中浸 泡90s，灭菌 水清 洗2次 3 次，再放 入0.2 次氯酸 钠（Naclo）中浸 泡3 min 5 min，灭菌 水 清洗2 次 3 次，用 灭菌 滤纸吸干 茎段 表面 的水 分，并将茎 段切 开，然
6、后 放入 少量灭 菌水 中浸 泡10 min，待看 到明 显的 菌液 渗出，DB43/T 20082021 2 吸取细 菌粗 悬液，涂 布在TZC（氯 化三 苯四 氮唑）固 体选择 性培 养基 上，放入30 恒 温箱 中培 养 48 h，用灭菌 的牙 签挑 单个 红色 菌落，接种 至TZC 液 体培 养基中 后，放入30 摇 床 培养 48 h，用细 菌提 取试剂盒提 取菌 液DNA，利用PCR（聚 合酶 链式 反应）技 术扩增 青枯 菌特 异片 段，并进行 测序 鉴定（青 枯菌鉴定引 物见 表1）。表1 青枯 菌鉴 定特 异引 物 引物名称 引物序列 目的片段长度 退火温度 正向引物 GTC
7、GCCGTCAACTCACTTTCC 280bp 60 反向引物 GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCG 4.2 病原 物的 繁殖 4.2.1 病 原物 的繁 殖 将青枯 菌菌 液吸 取 10 L 20L 涂 布或 划线 于TZC 固体 选择 性培 养基 上，放入 30 恒温 箱中 倒置培 养48h。用 灭菌 的牙 签挑单 个菌 落，接种 TZC 液体培 养基 中后，放 入 30 摇 床进 行培 养。4.2.2 TZC 选 择性 培养 基 的配制 现配现 用，3 g 蔗糖，5 g 10 g 蛋 白胨，3 g 牛肉 浸膏，7 g 琼脂 粉，加蒸 馏水定 容 至 1000 ml，调 pH
8、 值至7.0，高 温灭 菌 后加 入 0.05 的氯 化三 苯 四氮唑。4.3 接种 体的 制备 将增殖 培养 的病 原菌 液用 无菌水 稀释，用 紫外 分光 光度计 在波 长 600 nm 处 测定病 菌浓 度，将菌 液浓度调 制成 为 108cfu/mL（OD600=0.1）悬浊 液。5 室 内抗 性鉴 定 5.1 鉴定 室 人工接 种鉴 定室 应具 备人 工调节 温度、湿 度和 光照 的条件，使 人工 接种 后具 备良好 的发 病环 境。5.2 鉴定 设计 鉴定材 料顺 序或 者随 机排 列，每 份材 料重 复3 次，每一重 复 10 株 苗。5.3 鉴定 材料 准备 待鉴定 的种 子先
9、 在2 的NaClo 溶液 中浸 种8 min 10min，用 灭菌 水冲 洗干 净 后置 于 28 的 恒温培养箱 中催 芽，露白 后播 种于育 苗钵 内。育苗 基质 为草木 灰（或草 炭）、蛭 石、菜地 土 以 211 的比例混合（或 沙性 土壤 与草 炭以 3 2 的比 例混 匀），并经高 温蒸 汽灭 菌（134，40min），在温 室或 大棚里育苗，温 室或 大棚 的温 度控制 在 25 2。幼苗 应生长 健壮、大 小一 致。5.4 接种 5.4.1 接 种期 5 片 6 片 真叶 进行 接种。DB43/T 20082021 3 5.4.2 接 种体 浓度 接种浓 度 108cfu/m
10、L。5.4.3 接 种方 法 采用伤 根-蘸根 法进 行人 工接种，先 用 刀 将植 株根 部切伤，再 将 50mL 菌液 倒 入营养 钵中。5.4.4 接 种后 的管 理 每天浇 水 1 次 2 次保 持 土壤湿 润，保持 白天 温度 为 30 2，夜 间为28 2，相 对湿 度（RH）95。6 病 情调 查 6.1 调查 时间 接种 后7 d 15 d 调 查病 情。6.2 病情 级别 划分 病情级 别及 其相 对应 的症 状描述（见表 2）。表2 茄子 抗青 枯病 室内 鉴定病 情级 别的 划分 病情级别 病情描述 0 全叶无叶片感病 1 0.5 片1 片叶失水萎焉状 2 2 片3 片叶
11、片枯萎 3 3 片以上叶片枯萎 4 全部叶片枯萎死亡 6.3 调查 方法 调查每 份鉴 定材 料接 种病 原物后 的发 病情 况，依 据 病害症 状描 述，逐 份调 查 和登记 病情 级别，计算出病情 指数（DI）。病情 指 数的计 算见 公式（1）计 算。病情指 数计 算公 式1：100)(S Nn sDI（1）公式中:DI 病 情指 数；s 各病情 级别 的代 表 数值；n 各 病情 级别 的植 株 数；N 调 查总 植株 数；S 最 高病 情级 别的 代 表数值；DB43/T 20082021 4 7 抗 病性 评价 7.1 抗病 性评 价标 准 根据病 情指 数（DI）确定 其抗性 水
12、平，划 分标 准（见表 3）。表3 茄子 抗青 枯病 鉴定 的评价 标准 病情指数（DI）抗性评价 DI=0 免疫（I）0 DI 20 高抗（HR）20 DI 40 抗病（R）40 DI 60 中抗（MR）60 DI 80 感病（S）DI 90 高感（HS）7.2 鉴定 结果 的有 效性 判 别 当感病 对照 材料 达到 其相 应感病 程度（DI 50），该 批次的 抗青 枯病 鉴定 即为 有效。8 抗 性鉴 定记 载 茄子抗 青 枯 病鉴 定结 果记 载（见附录 A）。DB43/T 20082021 5 附 录 A（资料 性）茄子抗 青枯 病鉴 定结 果记 载 表A1 茄 子抗 青枯 病鉴 定 结果记 载表 编号 品种 名称 重复 区号 病情级别 病情指数 0 1 2 3 4 A B C 评价病指 抗性评价 播种日期 接种日期 病原分离物编号 病原物接种浓度 调查日期 调查人员
