1、湖南省地方标准DB43湖南省市场监督管理局 发 布DB43/T168 2020 92020-12-29发布 2021-03-29实施穗状狐尾藻生长抑制试验操作规程Guideline for L.Growth Inhibition Test Myriophyllum VerticillatumICS 65.020CCS B 16DB43/T 19682020 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规 范性 引用 文件 1 3 术 语和 定义 1 3.1 扦插 1 3.2 预培 养 1 3.3 植物 长 1 3.4 植物 鲜重 1 3.5 植物 干重 1 4 试 验条 件 2 4.1 温度 2 4.
2、2 光照 2 4.3 曝气 2 4.4 暴露 方式 2 4.5 试验 周期 2 5 材 料准 备 2 5.1 沉积 物的 制备 2 5.2 培养 基的 制备 2 5.3 生物 试材 的预 培养 2 6 试 验仪 器设 备 3 7 试 验方 法 3 7.1 试验 准备 3 7.2 预试 验 3 7.3 正试 验 3 7.4 限度 试验 3 7.5 参比 试验 3 8 观 察记 录 3 9 浓 度检 测 4 10 数 据处 理 4 11 质 量保 证与 质量 控制 5 附录A（资 料性）SMART and BARKO 培 养基 配制 方 法 6 附录B（资 料性）预培 养土培 法“沉积 物-狐尾
3、藻”系统 图 7 附录C（资 料性）试验“沉积 物-狐尾 藻”系统 图 8 DB43/T 19682020 II DB43/T 19682020 III 前 言 本文件 按 照GB/T 1.1 2020 给 出的 规则 起草。本文件 某些 内容 可能 涉及 专利。本文 件发 布机 构不 承担识 别这 些专 利的 责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提出。本文件 由湖 南省 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本文件 起草 单位：湖 南省 植物保 护研 究所,长 沙艾 格 里生物 科技 有限 公司。本文件 主要 起草 人：刘勇、陈昂、张 德咏、张 战泓、蒋桂 芳、罗杰、熊 浩、陈武瑛、罗 香
4、文。DB43/T 19682020 IV DB43/T 19682020 1 穗状狐尾 藻生长 抑制试验 操作规 程 1 范围 本文件 规定 了穗 状狐 尾藻（Myriophyllum Verticillatum L.）生长抑 制试 验的 试 验条件、材 料的 准备、操作方 法、观察 记录、数 据处理、质 量保 证与 质量 控制等。本文件 适用 于湖 南省 穗状 狐尾藻 生长 抑制 试验 的试 验操作。2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不
5、注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。3 术 语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 扦插 Cuttage 扦插也 称插 条，是一 种培 育植物 的常 用繁 殖方 法。可以剪 取某 些植 物的 茎、叶、根、芽等，插入 土中、沙 中，或浸 泡在 水中，等到 生根 后就 可栽 种，使之成 为独 立的 新植 株。3.2 预培养 Pre-Culture 在与试 验系 统相 同的 环境 下进行 预备 试验，目 的是 使试验 植株 能够 提前 适应 试验环 境，提高 植株 的成活率，从 而保 证试 验的 质量。3.3 植物长 Plant Le
6、ngth 是指将 穗花 狐尾 藻从 花盆 完整取 出，包括 水面 上植 物和沉 积物 中植 物根 系部 分，将 植物 垂直 从上 到下的长 度。3.4 植物鲜 重 Plant Fresh Weight 轻轻的 将狐 尾藻 从烧 杯中 取出，包括 根部，洗 去泥 沙。如 果有 断裂 的根 部在 泥土中，将 断裂 的根 部一同取 出，并洗 净。将植 物放在 吸水 纸上 吸干 植物 的多余 水分，然 后称 重。3.5 植物干 重 Plant Dry Weight 轻轻的 将穗 状狐 尾藻 从烧 杯中取 出，包括 根部，洗 去泥沙。如 果有 断裂 的根 部在泥 土中，将 断裂 的根部一 同取 出，并洗
7、 净。放在烘 箱中，60 烘干 至 恒重，然后 测干 重。DB43/T 19682020 2 4 试 验条 件 4.1 温度 20 25。4.2 光照 采用LED 灯 光照。每 天光 照时 间 16 h。光照 强度 约800010000 Lux。4.3 曝气 试验开 始前，每 个容 器内 增氧曝 气 12 h。试 验期 间，试验 容器 内不 能曝 气。4.4 暴露 方式 静态法。4.5 试验 周期 14 天。5 材 料准 备 5.1 沉积 物的 制备 应准备 两种人 工土，无营 养盐人 工土和 加入 营养盐 的人工 土（表 2）。为了狐 尾藻根 部可以 吸收 到营养盐，保 证植 物正 常生 长
8、。含 营养 盐的 人工 土需 要加 入 300 mg/kg 的 Na3PO4 12H2O 和 150 mg/kg 的NH4Cl。详 细配 制方 法见 附 录 A 的表 A1、表 A2。5.2 培养 基的 制备 试验选 用SMART and BARKO 培养基，应 在试 验开 始前 配制好 足够 用量 的培 养基，确保 配制 用水 不含氯，用 水水 质应 符 合NY5051 的 规定。SMART and BARKO 培 养基 配制 方法 参见 附录A 的 A.3。5.3 生物 试材 的预 培养 5.3.1 预 培养（水 培）试验 前14 天，从保 种藻 中 剪取新 枝条，均 长 约5 cm，在配
9、 有SMART and BARKO 培养 基中 进行 预培养 7 天。5.3.2 预 培养（土 培）试验 前7 天，从 SMART and BARKO 培养 基中 选取 藻枝 条，剪 取没 有异 种侵 染，长势良 好，没有 侧枝的主枝 条进 行试 验前 的预 培养。5.3.3 沉 积物 预培 养（土 培系统 的制 备）于大玻 璃缸 中底 部加 入 4 cm 已配 制好 的有 营养 的沉 积物，再铺 上1 cm 无 营养 的沉积 物，最后 铺上一层 约3 5 cm 厚的 石英 砂，以 防加 入培 养基 时使 沉积物 移位。再 加缓 慢加 入约 25 cm 高的SMART and DB43/T 1
10、9682020 3 BARKO 培养 基。最后 将水 培好的 藻枝 条插 入沉 积物 中进行 预培 养，7 天 的后 用于试 验。参见 图附 录 B 的B.1。6 试 验仪 器设 备 游标卡 尺、培养 架、照度 计、pH 计、溶 解氧 仪、EC 测 定仪、2 L 烧 杯、量 筒、容 量瓶、剪 刀、移液器、色谱 分析 仪、质谱 分析仪 等。7 操 作方 法 7.1 试验 准备 7.1.1 狐 尾藻 枝条 的剪 切 于预培 养系 统中 挑取 长 约8 cm 的枝 条用 于试 验。7.1.2 试 验沉 积物 系统 的 制备 2L 玻璃 烧杯。底 部加 入 350 g 已 配制 好的 有营 养的 沉积
11、物，再 铺上 200 g 无 营养的 沉积 物，最 后铺上一 层 约35 cm 厚 的 石英砂，以 防加 入培 养基 时使沉 积物 移位。再 加缓 慢加入 约 1.5 L SMART and BARKO 培养 基。一天 后将9.1.1 中剪 切好 的枝 条扦 插 在OECD 沉 积物 上。参见 图 附录 C 的 C.1。7.2 预试 验 按正试 验的 要求 以较 大间 距设 置 45 个 浓度 处理 组，求出 供试 物使 试验 用藻 生长受 抑制 的最 低浓度和不 受抑制 的最 高浓度，在此 范围内 设置 正式试 验，试 验对照 组设 置 5 个 重复，试验处 理组 设置 3个重复，每 重复
12、扦插 一根 新枝。7.3 正试 验 在预试 验确 定的 浓度 范围 内以一 定比 例间 距（几何 级差控 制 在 3.2 倍以 内）设置 5 7 个浓 度组，并设置 一个 空白 对照 组，使用助 溶剂 的还 应增 设溶 剂对照 组，对照 组设 置 10 个重复，试 验处 理组 设置10 个 重复，每 重复 扦插 一 根新枝。7.4 限度 试验 设置上 限浓 度 为 100 mg a.i./L，即 在供 试物 达 到 100 mg a.i./L 时，未 对 藻产生 影响。对 照组10 个 重复，试 验处 理组 10 个重 复，每重 复扦 插一 根新枝。7.5 参比 试验 为检验实验室的设备、条件
13、、方法及供试生物的质量是否合乎要求，设置参比物质作方法学上的 可 靠 性 检 验。推 荐 使 用 3,5-二 氯 苯 酚 作 为 参 比 物 质 对 穗 状 狐 尾 藻 生 长 抑 制 试 验 进 行 检 测，EC50范 围在4.7 mg/L 至6.1 mg/L。8 观 察记 录 8.1 在试 验第0 天，随 机 选取 15 棵 试验 所用 狐尾 藻，测定 并记 录其 植物 鲜重 和植物 干重。DB43/T 19682020 4 8.2 在试 验第 0、7、14 天，详 细记 录试 验各 处理 每颗狐 尾藻 的植 物根 长、总茎长（包 括侧 枝长 度）、植物总 长。8.3 在试 验第0、7、1
14、4 天，记 录 pH 值、水 温、光 照强度、溶 解氧。8.4 在试 验第14 天，测 定并记 录试 验各 处理 组狐 尾藻的 鲜重 和干 重。8.5 在试 验第0、7、14 天，观 察主 茎 的 发育 状况，是否 有畸 形，是 否发 黄、萎蔫；细菌 滋生 或藻 类 污染；生 长状态 异常，如发 育不良、节间 距变 化、茎/叶扭曲、侧枝 增殖、叶组 织受损、松弛 现象、茎节片断化 等。根 的状 态（试 验结束 时），观察与 对照 组 组相比，是否 出现 下列情 况：无 根；少 根；生长情况一般；生 长状 况良 好，与对照 组相 似。9 浓 度检 测 在试验 第0、7、14 天，采 集试验 溶液
15、 样本 进行 真实 浓度检 测。10 数 据处 理 10.1 评估 参数 植物根 长的 总增 长率，植 物根长 的总 生物 量；总茎 长的总 增长 率，总茎 长的 总生物 量；植物 总长 的总增长 率，植物 总长 的总 生物量；植 株 鲜 重增 长率，鲜重 生物 量；干重 增长 率，干 重总 生物 量。10.2 统计 分析 所有数 据运用 适当的 统计 软件如 SAS、SPSS、DPS 进行方 差分析。确定 供试 物对供 试生物 的 LOEC和 NOEC 值。选 取处 理组 和 对照组 中穗 状狐 尾藻 的茎、根、整株 植物 的长 度、鲜重和 干重 分别 作为 计算平均比 生长 率抑 制百 分
16、率 和生物 量增 长量 抑制 百分 率的响 应变 量。10.2.1 平 均比 生长 率抑 制百分 率 穗状狐 尾藻 平均 比生 长率 的抑制 百分 率（Ir），其 计 算按式（1）：100%ct cIr（1）式中：Ir 植物 平均 比生 长率 抑制百 分率（）；c 空白 对照 组植 物生 长速率 平均 值；t 处 理组 植物 生长 速 率平均 值。生长速 率是 指植 株长 度、鲜重和 干重 的对 数随 时间 的变化。处 理组 和对 照组 中的每 一个 重复 计算 得出一个 生长 速率 值，每个 处理组 和对 照组 得到 一个 平均植 株生 长速 率值 和方 差值，计算 公式 按式（2）：tN
17、Ni jj-iln ln（2）式中：i-j 从试 验开 始时 间 i 到结束 时 间j 的 平均 比生 长率；Ni 在时 间i 时处 理组 或对 照 组的 测量 变量；Nj 在时 间j 时处 理组 或对照 组的 测量 变量；t 从 i 到j 的时 间。DB43/T 19682020 5 10.2.2 生 物量 增长 量抑 制百分 率 平均生 物量 增长 量抑 制百 分率（Iy）的计 算按 式（3）：100%bcbt bcIy（3）式中：Iy 平均生 物量 增长 量 抑制百 分率（）；bc 对照 组最 终生 物量 与初始 生物 量之 差；bt 处 理组 最终 生物 量 与初始 生物 量之 差。1
18、1 质 量保 证与 质量 控制 11.1 用于 试验 的新 枝条 长度规 格应 尽量 一致，不 能超 过 20 误 差。11.2 供试 新枝 条必 须没 有其他 异种 的侵 染，如绿 藻等。11.3 试验 过程 中空 白对 照组 的 pH 变化 不能 超过1.5 个 单位。试 验区 域光 照 强度偏 差不 能超 过 15。DB43/T 19682020 6 附 录 A（资料 性）SMART and BARKO 培 养基 配制方 法 表 A.1 人 工土 的配 方 成分 试剂用量 备注 泥炭藓 4-5 pH 尽量接近5.5-6.0；泥炭是 粉末状的，粒径1 mm，干燥 的。高岭土 20 高岭石含
19、量最好超过30。石英砂 75-76 50以上细沙粒径在50 um 和200 um 之间。(0.0 5mm-0.2 mm)湿度 20-30 加入去离子水，湿度控制在 20-30。pH 7 0.5 加入 CaCO3 调pH。表 A.2 沉 积物 配比 OECD 沉积物 泥炭藓（kg）高岭土（kg）石英砂（kg）去离子水（kg）总重（kg）含营养物 6*5=0.3 6*20=1.2 6*75=4.5 1 L 含(Na3PO4 1.8 g；NH4Cl 0.9 g)6 不含营养物 3*5=0.15 3*20=0.6 3*75=2.25 0.5 L 3 注：1）计算的土壤含水率为 14。（不是最终的含水率
20、）2）将 Na3PO4 和 NH4Cl 溶于去离 子水，用配制好的溶液与土混匀。A3 SMART and BARKO 培 养基的 配制 表A.3 SMART and BARKO 培养基 配制 表 化学成分 浓度(mg/L)CaCl2*2H2O 91.7 MgSO4*7H2O 69 NaHCO3 58.4 KHCO3 15.4 pH 7.5-8 DB43/T 19682020 7 附 录 B（资料 性）预培养 土培 法“沉积 物-狐 尾藻”系统 图 图 B.1 预 培养 土培 法“沉积物-狐 尾藻”系 统图 DB43/T 19682020 8 附 录 C（资料 性）试验“沉积 物-狐尾 藻”系 统图 图 C.1 试 验“沉积 物-狐 尾藻”系统 图
