1、 ICS 65.020.30 CCS B 43 41 河南省地方标准 DB41/T 2273 2022 肉牛快速 扩繁技术 规程 2022-06-29 发布 2022-09-28 实施 河南省市 场监督 管 理局 发 布 DB41/T 2273 2022 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 同 期发 情和 人工 授精.1 5 胚 胎生 产与 移植.2 6 妊 娠牛 饲养 管理.5 附录A（资 料性）供体 牛信息 记录 表及 胚胎 冷冻 记录表 样式.6 附录B（资 料性）早期 胚胎发 育形 态图.7 附录C（资 料性）受体 牛胚胎 移
2、植 记录 表.8 DB41/T 2273 2022 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分：标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定起草。本文件 由河 南省 农业 农村 厅提出 并归 口。本文件 起草 单位：河 南省 畜牧总 站、河南 省农 业科 学院畜 牧兽 医研 究所。本文件 主要 起草 人：张 子 敬、刘贤、吕 世杰、王 二耀、茹 宝瑞、李 志明、王 李辉、吴 胜军、蔡 雯雯、施巧婷、郎利 敏、黄辉、夏宗军、丁涵、徐 美芳、赵杨杨、马超 峰、辛晓玲、于翔、王献 伟、马文 涛、李静、王培育、朱 肖亭、楚秋霞、付泰、王 欧阳、余亚飞、李惠、刘
3、 艳丽、蔡顺姬、余洪 涛、周应 海、黄永震、徐 照学。DB41/T 2273 2022 1 肉 牛快速 扩繁技术 规程 1 范围 本文件 规定 了肉 牛快 速扩 繁 中同 期发 情、超数 排卵、胚胎 移植 等要 求 和 方法。本文件 适用 于规 模化 肉牛 养殖的 快速 扩繁。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 4143 牛 冷冻 精液 NY/T
4、1335 牛 人工 授精 技 术规程 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 供体 牛 提 供胚 胎的 母牛。3.2 受体牛 接受 胚胎 的母 牛。3.3 同期 发情 利用外源 激 素控 制并 调整 母牛群 体发 情周 期进程，使其 在 规定 时间 内集 中发 情。3.4 超数排 卵 利用 外 源激 素诱发 母 牛卵 巢多个 卵泡 发育，并 同时 排出多 个具 有受 精能 力的 卵子。3.5 人工授 精 借助专 门 器 械将 公牛 精液 输入发 情母 牛的 生殖 道内 使其受 孕的 过程。3.6 胚胎移 植 将供体 牛体 内或 其 它 方式 获得的 早期 胚胎，移 植到
5、 对应生 殖周 期的 受体 牛体 内，使 之继 续发 育 的 生物技术。4 同期发 情和 人工 授精 DB41/T 2273 2022 2 同期发 情方 法 4.1 4.1.1 二 次前 列腺 素（PG）法 适配母 牛 任 选一 天肌 肉注 射PG，9 d 13 d 进 行第 二 次 注射，24 h72 h 观察 发情。4.1.2 黄体酮 缓释 阴道 栓法 适配母 牛 任 选一 天放 入黄 体酮缓 释阴 道栓，5 d 7 d 撤栓 并注 射PG，24 h 72 h 观察 发情。人工授 精 4.2 冷冻精 液应 符合GB/T 4143 的要求。人 工授 精操 作按 照NY/T 1335 的 规定
6、。5 胚胎生 产与 移植 供体牛 选择 与饲 养管 理 5.1 5.1.1 供体牛 选择 品种优 良，系谱 清晰，体 型外貌 和生 产性 能评 级一 级 以上，生 殖器 官正 常，无繁殖 障碍 疾病。年 龄15月龄 至8 周 岁。青 年牛 应 为15月龄 18 月龄，体 况 中上等 且至少 有两 次正常 发情 记 录；经产 牛 应为 产后60 d 以上，有 两次 正 常 发 情记录 且子 宫恢 复正 常。确定为 供体 牛前 应进行 检疫，有传 染性疾 病的 母 牛不能作 为供 体。5.1.2 供体牛 饲养 管理 保持饲 养环境 良好，避免 应激反 应。提 供合 理的配 合 日粮 和清洁 饮水。
7、超数 排卵 前3 周加 强饲 养 管理，补 充维 生素 和微 量元 素，保 持中 等以 上膘 情。供体牛 超数 排卵 及人 工授 精 5.2 5.2.1 超数排 卵 5.2.1.1 同期发 情方 法 准备工 作完 成后，同 期发 情 方法 按照 4.1 的 规 定。5.2.1.2 超数排 卵方 法 以母牛 发情 当天 为0 d，第9 d 13 d 中 的任 意一 天开始，每天 早（7:00 8:00）和 晚（19:00 20:00）各注射1次 促卵 泡素（FSH），连 续4 d 递减 注射。注射FSH 期间 第3 d 晚和第4 d 早同时 注射0.4 mg 0.6 mgPG。超数排 卵药品 使
8、用 根 据不 同 生产 厂家 的推 荐量 结合 体重 稍 作调 整。5.2.1.3 供体牛 发情 鉴定 最后一 次注 射FSH 后，每隔6 h观察 是否 发情，每次 观 察 不少 于30 min。以 母牛 被跨稳定 作 为发 情标准，准 确记 录时 间。5.2.2 人工授 精 精液剂 量加 倍，按照4.1.2 规定操作，间隔12 h 重复 操作一次。非手术 冲胚 及胚 胎质 量鉴 定 5.3 DB41/T 2273 2022 3 5.3.1 冲胚步 骤 5.3.1.1 供体牛 人工 授精 后 6 d7 d 冲 胚。冲胚 前，所用 仪 器、器 皿等 应经 过严 格的 消毒灭 菌处 理。冲胚管 应
9、检 查气 囊是 否漏 气。5.3.1.2 将供体 牛保定，清 除粪便，在荐 椎和第 一尾 椎结合 处或第 一尾椎 和第 二尾椎 结合处 注射 普 鲁卡因实 行硬 膜外 麻醉，直 至尾巴 松弛 柔软 无张 力。普鲁卡 因用 量 依 据说 明 书。5.3.1.3 麻醉后 将牛 尾固 定，清洁 会阴部 及外 阴，酒精 棉球 或喷雾 消毒 外阴，用 灭菌 卫生纸 擦干。5.3.1.4 用扩张 棒扩 张子 宫颈，再 用黏液 棒抽 出黏液。5.3.1.5 此时直 肠易 进空 气形 成空 洞，使 用抽 气筒 排出 空气，利于 直肠 把握。5.3.1.6 冲胚管 装配内 芯，并用冲 胚液润 滑，慢 慢插 入一
10、侧 子宫角，当冲 胚管 到达子 宫角大 弯处，旋开内芯 旋钮，拔 出内 芯 5 cm 左 右，握紧 内芯 和冲 胚 管并向 前推 进，使内 芯再 次到达 子宫 角大 弯处。重复内芯 拔出 和一 体前 进 1 3 次。给 冲胚 管气 囊充气 5 mL 确定 冲 胚管 到达 子 宫角前 端。冲 胚液 可用 杜 氏磷酸盐 缓冲 液（D-PBS）或 商用冲 胚液。5.3.1.7 给冲胚 管气 囊充 气 约8 mL14 mL，抽出 内芯，把 三 通管与 冲胚 管连接，连上 集卵滤皿。5.3.1.8 夹住三 通管 的回 流端，将20 mL 30 mL 冲胚 液 通 过 注入端 注入 子宫 角。夹住 注入端
11、，松 开回流端使 子宫 角液 体回 流到 集卵滤皿。重复 几次，每次 增加冲胚液5 mL 10 mL，每 个子宫 角 总 用 量400 mL 500 mL。5.3.1.9 完成后 排出 气 囊空 气，另 一侧子 宫 进行 相同 操作。抽出冲 胚管，使前 端位于 子宫体，灌 注 抗生素，肌注 PG，做 好采 胚 记录（见表A.1）。5.3.2 胚胎质 量鉴 定 5.3.2.1 搜集胚 胎 集卵滤皿 放在 40 100 倍 体视显 微镜 下，逐 格检 查，捡 出的 胚胎 用培 养液 清 洗 3 次，放入 盖有 矿物油的培 养液 中35 37 暂存，捡胚 完 成后 进行 等级鉴定。培养 液可用 10
12、%牛血 清M199 或 其它 商用培养液。5.3.2.2 胚胎发育 期 此时胚胎处于以下发育期：桑椹胚(M)、致密桑椹胚(CM)、囊胚(B)、扩张囊胚(EXB)。胚胎发育形态图见 附录B。5.3.2.3 胚胎质 量等级 鉴定 根据胚 胎 形 态将 胚胎 依次 分为 A、B、C、D 四 级。A 级：优 秀胚。胚 胎整 体 边 缘轮廓 清晰，透 明带 完整 光滑，立体 结构 明显，实质 均匀，透明 度适 中，碎片量 少 于10%或者 没有，胚胎 的发 育阶 段与 预期 的发育 阶段 一致。B 级：良好 胚。胚胎 整体 边缘轮 廓清 晰，立体 结构 明显，碎片 小 于 20%，透 明度稍 暗或 稍浅
13、。C 级：一般 胚。轮廓 不清晰，透 明度 过暗 或过 淡，碎片化 超 过30%40%。D 级：不可 用胚。未 受精 的卵子、16 细 胞以 下 和 碎 片化 率 50%以上 的受 精卵。胚胎冷 冻保 存及 解冻 5.4 5.4.1 胚胎冷 冻与 保存 5.4.1.1 胚胎清 洗 A 级、B 级 胚胎 在 保 持液 中 清洗4 6 次。保持 液使 用 商用保 持液。DB41/T 2273 2022 4 5.4.1.2 胚胎平衡 胚胎用 冷冻 液清洗 4 6 次，室温 下平 衡5 min。冷 冻液使 用乙 二醇 商用 冷冻 液。5.4.1.3 胚胎装 管 将平衡 后的 胚胎 装 入 0.25 m
14、L 细 管，装管 顺序 见图1。标引序号说明：1 棉栓；2 保持液；3 空气；4 冷冻液；5 含有 胚胎的冷冻液；6 封口。图1 胚胎装 管图 装管后 做好 胚胎 情况 标记，内容 包括：生 产日 期、母牛号、公 牛号、数 量、发育期、质 量。示例：1 枚A 级桑椹胚标记为 1 MA，其中“1”表示数量，M 表示发育期，“A”表示质量。5.4.1.4 胚胎冷冻 冷 冻仪 降温 至-6，放入装有 胚 胎的 细管 平 衡5 min，用 液氮 冷冻 后的 镊 子轻触 细管 植冰，继 续平衡5 min，以0.6/min 的速率 下降 至-35，平 衡 5 min 后 投入 液氮，记录 冷冻 情况（见
15、表 A.2）。5.4.2 胚胎解冻 取出 装有 胚胎 的 细管，空气 中停 留 5 s 10 s 后，迅 速放 入 35 37 水 浴 45 s。擦干 细管，拔出细 管塞，装 入移 植 枪 并移植。受体 牛 选择 及饲 养管 理 5.5 5.5.1 受体 牛 选择 骨 盆较 宽，体型 匀称，体 高 130 cm 以上，乳 房 发育良 好，性情 温顺，营 养良好，中 等膘 情。青年牛体重 达到 成年 母牛 体重 的 75%；经产 牛3 胎以 下，应有两 个以 上连 续的 正常 发情周 期，泌 乳性 能、产犊性能 良好，无 连续 两次 人工授 精未 孕记 录。牛体 健康，子宫 弹性、厚 薄正 常，
16、卵 巢发 育正 常。5.5.2 受体牛 饲养 管理 单独 分 群、编 号、饲养，保 持环 境良好，避免 应激 反应，保 证必 要运 动，满足 营养需 要。移 植前 6 8 周开 始补 饲，日增 重 应 保 持在0.3 kg 0.4 kg。移植前 5 周 补充 维生 素 A、维 生 素D、维生 素E 及硒、锌等 微 量元 素。胚胎移 植 5.6 5.6.1 受体牛 同期 发情 DB41/T 2273 2022 5 按照4.1 的 规定。5.6.2 受体牛 发情 鉴定 按照NY/T 1335 的规定。5.6.3 受体牛 胚胎 移植 方法 5.6.3.1 以发情 当天定 为 0 d，于 7 d8 d
17、 进 行移植。移 植 前对受 体牛进 行直 肠检査，黄体 达到 A级的母 牛用 于移 植。5.6.3.2 受体牛 麻醉，按照 5.3.1.2 的规 定。5.6.3.3 清洗消 毒外阴 部并 擦干。对照胚 胎 记录 表和 受体牛 发情记 录，胚 胎发 育期与 受体牛 生理 时 间相对应：桑 椹胚、致密 桑 椹胚、囊胚 对应 受体 牛发 情后 7 d；扩张 囊胚 对应 受体牛 发情 后 8 d。5.6.3.4 装好胚 胎的 移 植枪 套上硬 外套管，再套 上无 菌外套 膜。于 子宫颈 口撕 破外套 膜，使 移植 枪 前段到达 黄体 侧子 宫角 前端，注入 胚胎。5.6.3.5 做好移 植记 录。胚
18、胎 移植 记录表 见附 录 C。6 妊娠牛 饲养 管理 人工授 精或 移植 后 30 d 60 d 进行 妊娠 检查，对 妊 娠牛加 强护理，防止 应激。产 前 2 个月 适当 限制能量 摄入，保持 适量运 动，同 时保证 足量 的维生 素 和微 量元素。围 产期加 强管理。分娩 时做 好护 理，必要时 助产 或剖 腹产。超 出预产 期 10 d 的母 牛应 诱 导分娩。DB41/T 2273 2022 6 A 附录A（资料 性）供体牛 信息 记录 表及 胚胎 冷冻记 录表 样式 A.1 供体牛 信息 记录 见 表A.1。表A.1 供体 牛信 息记 录表 牛号 品种 牛场 出生日期 胎次 产犊
19、日期 上次发情日期 最近发情日期 直肠检查情况 同期发情程序 药物 第一次处理 第二次处理 发情情况 超排处理程序 日期 药物厂家 批号及规格 FSH 早午 晚午 PG 其他 发情时间 输精时间 公牛号 剂量 活力 配种员 备注 冲胚日期 冲胚液回收 直肠检查结果 黄体 卵巢 子宫 左 右 左 右 左 右 冲胚结果 获胚总数 可用胚胎数 不可用胚胎数 备注 A.2 胚胎冷 冻记 录表见 表A.2。表A.2 胚胎 冷冻 记录 表 小筒编号 供体牛号 公牛号 细管号 细管颜色 胚胎数量 胚胎质量 冷冻日期 备注 B B DB41/T 2273 2022 7 附录B（资料 性）早期胚 胎发 育形 态图 早期胚 胎发 育形 态见 图 B.1。a）未受精卵或 1 细胞胚胎 b）2 细胞胚胎 c)4 细胞胚胎 d)8 细胞胚胎 e)桑葚胚 f)致密桑葚胚、囊胚、扩张囊胚 图B.1 早 期胚 胎发 育形 态 图 C C DB41/T 2273 2022 8 附录C（资料 性）受体牛 胚胎 移植 记录 表 受体牛 胚胎 移植 记录 表见 表C.1。表C.1 受体 牛胚 胎移 植记 录表 序号 受体号 发情日期 移植日期 子宫情况 黄体状况 胚胎编号 胚胎数量等级 移植情况 移植人 备注
