1、 ICS 65.150 CCS B 50 34 安徽省地方标准 DB34/T 4223 2022 黄缘闭壳 龟 Yellow-margined Box Turtle 2022-06-29 发布 2022-07-29 实施 安徽省市 场监督 管 理局 发 布 DB34/T 4223 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由合 肥市 畜牧 水产 技术推 广中 心提 出。本文件 由
2、安 徽省 农业 农村 厅归口。本文件 起草单 位：合肥市 畜牧水 产技术 推广 中心、安徽农 业大学、安 徽绿丰 园特种 养殖有 限公 司、安徽杰 与祥 水产 养殖 有限 公司、安 徽蓝 田农 业集 团 有限公 司、安 徽省 长江 水 生动物 保护 研究 中心、安 徽省水产 技术 推广 总站、肥 东县水 产技 术推 广站。本文件 主要 起草 人：赖 年 悦、苏时 萍、荣 朝振、张 万香、宋 啸帆、李西 雷、王孝政、项旭 东、贾 正增、方 国侠、沈 保平、高 凌、徐 丽、彭步 旭、鲍鸣、张四 刚、江孝 八。DB34/T 4223 2022 1 黄缘闭壳 龟 1 范围 本文件 给出 了黄 缘闭 壳
3、龟（Cuora flavomarginata Gray，1863）的 名称 与分 类、主 要形 态构 造 特征、生 长和 繁殖 特性、遗 传学特 征、检测 方法 和判定 规则。本文件 适用 于黄 缘闭 壳龟 的种质 检测 与鉴 定。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 18654.2 养殖 鱼类 种质检 验 第2 部分 抽 样 方法 GB/T 186
4、54.12 养 殖鱼 类 种质检 验 第12 部分 染 色体组 型分 析 GB/T 18654.15 养 殖鱼 类 种质检 验 第15 部分 RAPD 分析 GB/T 34727 龟 类种 质测 定 3 术语和 定义 GB/T 34727 界定 的术 语和 定义适 用于 本文 件。4 名称与 分类 学名 黄缘闭 壳龟（Cuora flavomarginata Gray，1863）。别名 夹板龟、克 蛇龟、断 板龟、黄缘 盒龟。分类 脊索动 物门（Chordata）、爬行纲（Reptilia）、龟鳖 目（Chelonia）、淡水 龟科(Geoemydidae)、闭壳龟属(Cuora)。5 主要形
5、 态构 造特 征 外部形 态特 征 5.1.1 外形 体呈椭 圆形，前部 略窄、后部略 宽。头 光滑 无鳞，鼓膜圆 而清晰，头 部背面 呈橄榄 色，两 眼后 各DB34/T 4223 2022 2 具 一条 金黄色 条纹，颈部 呈浅橘 红色。背甲 高而隆 起，背 甲由同 心轮 纹组成，中心 呈绛红 色或 棕红色，中央脊 棱明 显，呈金 黄色，侧棱 不明 显。腹 甲大 而 平坦，呈棕 黑色，腹甲 外 缘与缘 盾腹 面呈 黄色，腹甲与 背甲 间有甲 桥连 接，腹 甲前后 两部分 向上 闭合于 背甲，头、尾 及四 肢可完 全缩入 壳内。四肢 略扁平，上覆有 覆瓦 状排 列的 鳞片，呈灰 褐色，前 肢
6、基 部呈 浅橘红 色，具五 趾，趾端 具钝性 甲，后肢 基部 呈 淡 黄色，具 四趾，趾端 具钝 性 甲，趾 间具 微蹼，两后 肢 之间及 尾部 的皮 肤具 疣状 突起。成年 雌龟 尾短、基 部细，成 年雄 龟尾 长、基部 粗。黄缘闭 壳龟 的外 部形 态见 图 1，雌雄 背、腹面 观见 图 2。图1 黄缘闭 壳龟 外形 图 图2 黄缘闭 壳龟 龟背、腹 面观（左雌、右 雄）5.1.2 可数性 状 5.1.2.1 背甲 颈盾：1 枚。椎盾：5 枚。肋盾：8 枚，左 右各 4 枚。缘盾：22 枚，左右 各 11 枚。臀盾：2 枚，左 右各 1 枚。DB34/T 4223 2022 3 5.1.2
7、.2 腹甲 喉盾：2 枚，左 右各 1 枚。胸盾：2 枚，左 右各 1 枚。肱盾：2 枚，左 右各 1 枚。腹盾：2 枚，左 右各 1 枚。股盾：2 枚，左 右各 1 枚。肛盾：2 枚，左 右各 1 枚。5.1.2.3 甲桥 下缘盾：6 枚，左右 各 3 枚。腋盾：2 枚，左 右各 1 枚。胯盾：2 枚，左 右各 1 枚。5.1.3 可量性状 雌性体 重 52.3 g 297.5 g，背 甲长 50.3 mm 108.6 mm，年龄 3+6+；雄 性 体重 64.8 g 303.2 g，背 甲长 104.6 mm 121.2 mm，年 龄 4+6+。各 可 量性状 的比 例见 表1。表1 黄缘
8、闭 壳龟 背甲 长及 与可 量性状 比例 值 比例 雌龟 雄龟 平均值标准差 范围 平均值标准差 范围 背甲宽/背甲长 0.78 0.05 0.90 0.67 0.74 0.02 0.76 0.71 壳高/背甲长 0.45 0.03 0.53 0.38 0.48 0.04 0.56 0.44 腹甲宽/背甲长 0.60 0.03 0.66 0.52 0.60 0.01 0.62 0.58 腹甲后半部长/背甲长 0.34 0.04 0.60 0.23 0.33 0.02 0.34 0.30 腹甲前半部长/背甲长 0.54 0.06 0.63 0.06 0.53 0.02 0.56 0.52 腹甲后
9、半部前宽/背甲长 0.57 0.03 0.64 0.48 0.58 0.01 0.60 0.56 腹甲后半部后宽/背甲长 0.34 0.04 0.43 0.23 0.36 0.02 0.38 0.33 甲桥长/背甲长 0.32 0.03 0.44 0.24 0.33 0.02 0.35 0.28 喉盾宽/背甲长 0.14 0.05 0.23 0.07 0.14 0.05 0.20 0.08 喉盾缝长/背甲长 0.15 0.02 0.19 0.07 0.16 0.01 0.18 0.15 肱盾缝长/背甲长 0.07 0.01 0.12 0.05 0.07 0.02 0.09 0.05 胸盾缝长/
10、背甲长 0.19 0.02 0.24 0.13 0.20 0.02 0.22 0.17 腹盾缝长/背甲长 0.23 0.02 0.27 0.15 0.24 0.01 0.25 0.23 股盾缝长/背甲长 0.07 0.02 0.16 0.04 0.07 0.02 0.09 0.05 肛盾缝长/背甲长 0.26 0.05 0.59 0.17 0.25 0.02 0.27 0.22 注：各可量性状说明参见 GB/T 34727 内部构 造特 征 心脏具 有 2 心房 1 心 室，心室 内具半 隔膜。肺海 绵状，左右 2 叶，紧靠 前 部椎板 内侧。肝脏 3叶，左 右两 叶较 大，中 间 叶较小。后
11、 肾 1 对，位于 后部肋 板内 侧，各由 1 根 输尿管 通向 膀胱。食 道较长，胃 分化明 显，十二指 肠上附 有条形 白色 胰脏，无盲肠。雌雄 异体，雄性 睾丸 1 对，淡白 色，卵 圆形，位 于肾脏 前端 内侧，后端为 输精管，通 泄殖腔，阴茎 位于尾 基部 的泄殖 孔内；雌体卵 巢 1 对，位DB34/T 4223 2022 4 于肾脏 前端 内侧，紧 靠椎 板，呈 黄色 片状，内 有粒 状卵子，产 卵期 具多 个成 熟卵泡。6 生长和 繁殖 特性 生长 不同年 龄组 的黄 缘闭 壳龟 体长与 体重 的实 测值 变动 范围见 表2。表2 黄缘闭 壳龟 不同 年龄 组实 测 背甲 长、
12、背甲 宽与 体重 年龄，年 0+1+2+3+4+5+6+背甲长（mm）45.52.85 60.775.32 106.639.13 116.884.53 132.126.42 139.837.25 151.524.89 背甲宽（mm）37.411.4 49.082.62 79.607.130 84.183.81 93.485.06 101.967.02 107.644.73 体重（g）17.112.0 39.638.46 241.0135.16 298.0939.44 433.1357.0 533.99128.09 650.4678.41 注：生长方程和背甲长与体重关系式参加附录A 繁殖 6.2
13、.1 性成熟 年龄 自然条 件下，雌 龟为 6+性 成熟，雄龟 是 5+性 成熟。6.2.2 繁殖期 每年 5 月8 月产 卵，5 月中旬 6 月 上旬 为产 卵 高峰期。6.2.3 产卵类 型 一年多 次产 卵，一般 每年 产卵 1 次 4 次。6.2.4 产卵量 每只雌 龟每 年产 卵 1 枚/次4 枚/次。7 遗传学 特性 细胞遗 传学 特性 7.1.1 体细胞 染色 体数：2 n=52；染色 体臂 数（NF）：70；核型 公式：14m+4sm+24t+10mc。7.1.2 染色体 核型 见 图3，染色 体组型 见 图 4。DB34/T 4223 2022 5 图3 黄缘闭 壳龟 染色
14、体核 型图 图4 黄缘闭 壳龟 染色 体组 型图 分子遗 传学 特征 黄 缘闭壳 龟 线粒体 16SrRNA 基因片 段的碱基 序列为 1596bp，种内K2P 遗 传距离 为 0.0024，小 于 2，标准 序列 见附 录C。8 检测方 法 抽样 按 GB/T 18654.2 的 规定 执行。性状测 定 按 GB/T 34727 的规 定执 行。年龄鉴 定 按 GB/T 34727 的规 定执 行。细胞遗 传学 检测 DB34/T 4223 2022 6 以 10 ug/g 体 重剂 量给 龟腹腔 注射 植物 血球 凝集 素（PHA），处 理 24 h，以 6 ug/g 体重 剂量 腹腔注射
15、 秋水 仙素，3.5 h 后取脾 脏。0.0375 mol/L KCl低渗20 min。其 他步 骤 按 GB/T 18654.12 的 规定执行。分子遗 传学 检测 检测方 法应 符合 附录B 的规 定。9 判定规 则 当检验 结果 符合 第5 章和 第 7 章 的要 求，可以 判定 物种 时，按 第5 章和 第7 章的要 求判定。当出现 下列 情况 之一 时，增加检 测 第 6 章和 第 8 章 的要求 内容，依 据检 测结 果对物 种进 行辅 助 判定：a)第5 章和第 7 章 的项 目无 法进行 检测 或准 确判 定时；b)第三方 提出 要求 时。DB34/T 4223 2022 7
16、附录A（资料 性）黄缘闭 壳龟 生长 方程 和背 甲长与 体重 关系 式 A.1 体重、背甲 长和 背甲 宽生 长方程 见公 式（A.1）（A.3）。Wt1=12.73e 0.476（r=0.9843）(A.1)式中：Wt1 t 齢 时龟 体重，单 位为克（g）；T 龟的 年龄，齢。Lt=45.47 T0.466（r=0.9944）(A.2)式中：Lt t 齢 时龟 背甲 长，单位为 毫米（mm）；T 龟的 年龄，齢。Wt2=34.81 T0.461（r=0.9939）(A.3)式中：Wt2 t 齢 时龟 背甲 宽，单位为 毫米（mm）；T 龟的 年龄，齢。A.2 体重、背甲 长与 背甲 宽关
17、 系式 见 公式（A.4）（A.5）。Wt1=Lt3.018（r=0.9899）(A.4)式中：Wt1 t 齢 时龟 体重，单 位为克（g）；Lt t 齢时 龟背 甲长，单位为 毫米（mm）；T 龟的 年龄，齢。Lt=0.82Wt21.191（r=0.9925）(A.5)式中：Lt t 齢时 龟背 甲长，单位为 毫米（mm）；Wt2 t 齢 时龟 背甲 宽，单位为 毫米（mm）；T 龟的 年龄，齢。DB34/T 4223 2022 8 附录B（规范 性）黄缘闭 壳龟 线粒 体 16SrRNA 基因 分析 方法 B.1 总DNA 提取 取黄缘 闭壳 龟肌 肉组 织，剪碎，10 蛋白 酶K 消化，
18、DNA提 取试 剂盒 提取 总DNA。B.2 引物序 列 和PCR 扩增 条件 B.2.1 扩增引 物序 列为 16S F:5-CACAATAAACAAACAGATGAGGCAAGT-3；B.2.2 16S R:5-GAAAGCTACGGCGACGAGGA-3。PCR 扩增 条件 为：94，5 min；94，30 s，62，90s，共30 次 循环；72，30 s，72，10 min。其它 步骤按 GB/T 18654.15 的 规定执 行。B.3 PCR 产 物纯 化和 回收 取 5 L 扩增 产物 上样 到 1.0 的琼 脂糖 凝胶 进行 电 泳分离（见 图B.1），然 后 割胶，用凝 胶
19、抽 提试剂盒 进行PCR 产物 纯化、回收。纯化 产物 用于 测序 分析，进行 正反 双向 测序。图B.1 黄缘闭 壳龟 线粒 体 16SrRNA 基 因电 泳图 B.4 遗传距 离分 析 利用Kimura 两参 数模 型（Kimura 2 parameter，K2P）计算 样品 间两 两遗 传距 离。DB34/T 4223 2022 9 附录C（资料 性）黄缘闭 壳龟 线粒 体16SrRNA 基因 标准 序列 黄缘闭 壳龟 线粒 体16SrRNA 基因标 准序 列（1596bp）如下：1 GCAAGAACCT AGCCCAACCA AAATAAAAAA CTTAACAAAC AAAACTAT
20、CC 51 CACCAAAACC AACCAAAACA TTCTCACCAT CCTAGTATAG GCGATAGAAA 101 AGACAGTTGG AGCAATAGAG ATAGTACCGC AAGGGAAAGA TGAAAAACAA 151 TGAAATATTC ACTAAGCCAT AAAAAGCAAA GATTAATCCT TATACCTTTT 201 GCATCATGAT TTAGCTAGCA TATTCAAGCA AAGAGCCCTA AAGTATGAAA 251 CCCCGAAACT AAGTGAGCTA CTTAAAGGCA GCCACACCAA GGCTAAATCC 301
21、 GTCTCTGTGG CAAAAGAGTG GAAAGACCTG TAAGTAGAGG TGAAAAGCCT 351 AACGAACTTA GTGATAGCTG GTTGCTCAAT AAAAGAATAT AAGTTCAACC 401 TTAAACCTTC TAAAAACAAC CTAAAGTATA AAAGAAAAGT TTAAGATTTA 451 TTCAATTGGG GTACAGCCCA ATTGAAAAAG GATACAACCA ATAACGGAGG 501 ACAAAACCCC AAAAATAACA ACCGTAGGCC TTAAAGCAGC CACCAACTAA 551 GAAA
22、GCGTCA AAGCCCACCC GCTATTAAAT AGTAACAAAA AATTTTTTCC 601 CCTAATAATA TTGAGCTACT CCATTTAAAT AGAGGAATTA ATGCTAAAAT 651 GAGTAACAAG AAGACAAAAC TTCTCTAATA CGCTAGCTTA AGTCATAACA 701 GATAAACTAC TGACTATTAA CATCCATCAC TATAAAACAA CAACATTTTA 751 AATCACCCTA TAGACCTAAC TGTTAACCCA ACACAGGAGC GTATACAAGA 801 AAGATTAAA
23、A TTTGTAAAAG GAACTAGGCA AATAAACGAG CCCGACTGTT 851 TACCAAAAAC ATAGCCCCTA GCAACACAAG TATTAGGGGT AATGCCTGCC 901 CAGTGACACT GTTAAACGGC CGCGGTATCC TAACCGTGCA AAGGTAGCGT 951 AATCACTTGT CTTTTAAATA AAGACTAGAA TGAATGGCCA AACGAGGTTC 1001 TACCTGTCTC TTACAAATAA TCAGTGAAAT TGATCTTCCT GTGCAAAAGC 1051 AGGAATAACA T
24、TATAAGACG AGAAGACCCT GTGGAACTTC AAATACAAAT 1101 CAACTATTAT CAACACCCAC CTACGGGTCC ACATCAAACT AGCATCTGAC 1151 TTATATTTTC GGTTGGGGCG ACCTCGGAGT AAAATAAAAC CTCCGAAAAA 1201 GAATTTCCTT TTAAACCTAG ACCTACAGCC CACAGTGCTT CCAGCAAAAC 1251 GATCCAATAT ACTTGATCAA CGAACCAAGC TACCCCAGGG ATAACAGCGC 1301 AATCCCATCC T
25、AGAGTTCCT ATCGACGATG GAGTTTACGA CCTCGATGTT 1351 GGATCAGGAC ATCCTGATGG TGCAACTGCT ATCAAGGGTT CGTTTGTTCA 1401 ACGATTAACA GTCCTACGTG ATCTGAGTTC AGACCGGAGC AATCCAGGTC 1451 GGTTTCTATC TATAAGTTTA AGCCTTTTCT AGTACGAAAG GACCGAAAAG 1501 ACAAGGCCCA TACTAAAAAC AAGCCTTACC TTACATTAGT GAAAACAACT 1551 TAACTAATAA TAAGAAAAAC AAACCACAGC CCTAAAAAAG GGCCTA
