1、 ICS 11.220 CCS B 41 34 安徽省地方标准 DB34/T 4203 2022 猪肠外致 病性大肠 杆菌分离 鉴定规程 Regulation for detection of extraintestinal pathogenic Escherichia coli from swine 2022-06-29 发布 2022-07-29 实施 安徽省市 场监督 管 理局 发 布 DB34/T 4203 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容
2、 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本 文件 由安 徽农 业大 学提 出。本 文件 由安 徽省 农业 农村 厅 归口。本 文件 起草 单位：安 徽农 业大学，安 徽浩 翔农 牧有 限公司，马 鞍山 史记 动物 健康管 理有 限公 司，安徽省动 物疫 病预 防与 控制 中心，阜 阳市 动物 卫生 监 督所，合 肥市 动物 疫病 预 防控制 中心，阜阳 市颍东区枣庄镇 农业 综合 服务 站，巢湖市 畜牧 兽医 局，六 安 市动物 疫病 预防 与控 制中 心，滁州 市凤 阳县 府城 畜 牧兽医站，安 徽省 猪业 协会。本 文件 主要 起草 人：李郁，李亮，谢 玉洁
3、，黄 晓慧，李超，邢 刚，刘雪 兰，段倩倩，李 春芬，程 圣芳，孙 裴，何长 生，高亚 飞，陈 田梅。DB34/T 4203 2022 1 猪肠外致 病性大 肠杆菌分 离鉴定 规程 1 范围 本 文件 规定 了猪 肠外 致病 性大肠 杆菌 分离 鉴定 所需 的主要 设备 和材 料、操作 规程、结果 报告 和废弃物无害 化处 理与 人员 安全 防护。本 文件 适用 于猪 肠外 致病 性大肠 杆菌 的分 离鉴 定。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文
4、件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 4789.6 食 品安 全国 家 标准 食品 微生 物学 检验 致泻大 肠埃 希氏 菌检 验 GB 4789.38 食 品安 全国 家标准 食 品微 生物 学检 验 大肠 埃希 氏菌 计数 GB 4789.41 食 品安 全国 家标准 食 品微 生物 学检 验 肠杆 菌科 检验 GB 19489 实验 室 生物 安 全通用 要求 SN/T 2025 动 物检 疫实 验 室生物 安全 操作 规范 SN/T 2984 检 验检 疫动 物 病原微 生物 实验 活动 生物 安全要 求细 则 3 术语和 定义
5、 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。肠外致 病性 大肠 杆菌 extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC 是一组 不同 种类 的不 仅可 正常定 殖于 畜禽 等 肠 道，而且能 侵入 血液 循环 系统 引起菌 血症，并 诱发 败血症或 局部 肠道 外感 染的 大肠杆 菌。4 主要 设 备和 材料 显微镜：10 100。电子天 平：感 量0.1 g。恒温培 养箱：37。冰箱：0 4。无菌培 养皿：直 径 75 mm 或90 mm。无菌试 管：12 mm 100 mm，15 mm 150 mm。麦氏比 浊管。pH 计、pH 比色 管或 精
6、密pH 试纸。饱和氯 化钠 溶液：见 附 录A 中A.1。30 甘 油缓 冲盐 水溶 液：见附 录A 中 A.2。DB34/T 4203 2022 2 麦康凯 培养 基（MAC）：按照 GB 4789.6 规定 执行。革兰氏 染色 液：按照 GB 4789.41 规定 执 行。三糖铁（TSI）琼脂 斜面 培 养基：按照 GB 4789.6 规定 执行。蛋白胨 水和 靛基 质试 剂：按照 GB 4789.6 规定 执行。缓冲葡 萄糖 蛋白 胨水 和甲 基红试 剂、V-P 试剂：按照 GB 4789.38 规定 执行。枸橼酸 盐 培 养基：按照 GB 4789.38 规定 执行。LB 固 体培 养
7、基：见 附录A 中A.3。试验小 鼠：68 周龄，体重 18 g22 g，清 洁级。大肠杆 菌 O 抗 原单 因子 标 准血清。5 操作规 程 操作流 程 ExPEC 分离 鉴定 的 流 程示 意 图见附 录B。操作步 骤 5.2.1 样品采 集 5.2.1.1 采集：无菌操 作采 集病猪 的肝脏、肺脏、脾 脏、淋 巴结、脑 等肠 外组 织，或 关节积 液、心 包积液。5.2.1.2 保存 与 运输：病 料样 品 采 集后 不 能及 时 送 检的，可 保存于 饱和 氯化 钠溶 液或 30 甘油 缓 冲盐水溶 液中，保 存时 间不 超过 72 h。样 品均 需采 取 低温（0 4）保 存和 运
8、输。5.2.2 细菌分离 与 纯化 无菌操 作 将 病料 样品 接种 于 麦康 凯培 养基（MAC），37培 养 18 h 24 h，挑 取 疑似 单个 菌落（菌落呈鲜 桃红 色或 粉红 色，中等大 小，直径 1.0 mm 2.5 mm，圆 形，边缘 整齐，表面 光滑）再 次划 线 接种于MAC，37 培养 18 h 24 h（即 纯 化）后进 行 大肠杆 菌 鉴 定。5.2.3 肠外大 肠杆 菌鉴 定 5.2.3.1 形态特征 鉴定：革 兰氏染 色镜检。大肠 杆菌 为革兰 氏阴性 直短杆 菌，两端钝 圆，无 芽孢，多散在，也有 成对 排列。5.2.3.2 生化特 性鉴 定：先取 纯化 菌落接
9、 种三 糖铁（TSI）琼 脂斜面 培养 基，37 培养 18 h24 h。大 肠杆 菌为 斜面 和底 面 均 变黄或 变红，产 气，不产 H2S。之 后将 纯化 菌落 分别 接种蛋 白胨 水、缓冲 葡 萄糖蛋白 胨水、枸 橼酸 盐 培 养基，37 培养 18 h 24 h，进 行吲哚 试 验（I）、甲基 红试 验（MR）、V-P 试验（Vi）、枸橼 酸盐 利用试 验（C），简 称IMViC 试 验。大 肠 杆菌 为IMViC。按照 GB 4789.38、GB 4789.6 执行。5.2.4 肠外大 肠杆 菌致 病性 鉴定 取10只 健康 状态 良好 小鼠，分 成试 验组 和对 照组，每 组 5
10、 只。将5.2.3 中两 条 鉴定均 符合 的大 肠杆菌分离 株制 成浓 度约 为 0.5 麦氏 比浊 度的 菌悬 液，分别腹 腔注 射试 验组 小鼠，每只 0.3 mL。对照组 小鼠每只 腹腔 注射 0.3 mL 用于稀 释菌 液的 无菌 生理 盐水。注射 后观 察 3 d 内小鼠 精神 状况 及死 亡情况。若对 照组 小鼠 均健 活，试验组 小鼠 出现 精神 萎靡，不进食，静止 抱团 不活 动，最后死 亡的 临床 症状，并将死 亡的 小鼠 在无 菌操 作下取 其肺 脏、肝脏、脾 脏组织 分别 接种 于MAC，37 培养 24 h，挑 取大 肠DB34/T 4203 2022 3 杆菌疑 似
11、菌 落进 行革 兰氏 染色镜 检，将符 合大 肠杆 菌 形态特 征的 细菌 纯化 后接 种TSI，并 进行IMViC 试验，结果与 接种 菌株 一致 则说 明待检 大肠 杆菌 分离 株为ExPEC。5.2.5 肠外致 病性 大肠 杆 菌 O 抗 原血清 型鉴 定 见附录C。5.2.6 肠外致 病性 大肠 杆菌 系统 进化群 鉴定 见附录D。6 结果报 告 符 合 5.2.2，5.2.3，5.2.4，可 确定 为ExPEC。符合6.1，且根 据5.2.5，可确定 为某 种O 抗原 血清 型 的 ExPCE。符合6.1，且根 据5.2.6，可确定 为某 种系 统进 化群 的ExPCE。7 废弃物
12、无害 化处 理与 人员 安全防 护 应 按照 GB 19489、SN/T 2984 和 SN/T 2025 的规 定 执行。DB34/T 4203 2022 4 附录A（资料 性）培养基 的配 制 A.1 饱和氯 化钠 溶液 A.1.1 成分 氯化钠 38.0 g 39.0 g 蒸馏水 100 mL A.1.2 制法 将 38.0 g 39.0 g 氯化 钠 加入 100 mL 蒸馏 水 中，充分 搅拌，待 完全 溶解 混匀后，分 装于 采 样管，每 管 5 mL 10 mL，121 高压 灭菌 15 min 备用。A.2 30 甘 油缓 冲盐 水溶 液 A.2.1 成分 氯化钠 0.5 g
13、碱性磷 酸钠 1.0 g 中性甘 油 30 mL 蒸馏水 100 mL A.2.2 制法 先将盐 类成 分溶 于水 中，然后加 入甘 油，混匀，分 装于采 样管，每管5 mL 10 mL，121 高压 灭菌15 min 备 用。A.3 LB 固 体培 养基 A.3.1 成分 胰蛋白 胨 10.0 g 酵母提 取物 5.0 g 氯化钠 10.0 g 琼脂 15.0 g20.0 g 蒸馏水 1000 mL A.3.2 制法 将 A.3.1 中各 成分 溶于 蒸 馏水中，加 热溶 解，校正pH 至 7.40.2，121 灭菌 20 min，待冷 却至50 左右 时倾注 平 板。DB34/T 4203
14、 2022 5 附录B（资料 性）猪肠外 致病 性大 肠杆 菌分 离鉴定 流程 见 图B.1。图B.1 猪肠外 致病 性大 肠杆 菌分 离鉴定 流程检 样 麦康凯 培养 基分 离培 养（菌落 呈鲜 红色 或粉 红色，中等 大小，直 径 1.0 mm2.5 mm，圆形，边 缘整 齐，表 面光 滑）选取可 疑菌 落涂 片镜 检、纯培养（革兰 氏阴 性直 短杆 菌，两端钝 圆，无芽 孢，多散 在，也 有成 对排 列）生化试 验（TSI：斜 面和 底面 均变 黄 或变红，产 气，不 产 H2S。IMViC+-）肠外大 肠杆 菌 动物试 验 肠外致 病性 大肠 杆菌 结果报 告 O 抗原 血清 型PCR
15、 鉴定 系统进 化 群 PCR 鉴定 DB34/T 4203 2022 6 附录C（资料 性）猪肠外 致病 性大 肠杆 菌 O 抗原血 清型 鉴定 C.1 ExPEC 的O 抗原 制备 将ExPEC 接 种于LB 固 体培 养 基上，37 培养 18 h 24 h，用 3mL 0.5 石 炭酸生 理盐 水将 菌苔洗下，置于 试管 中，制成 浓稠的 悬液，121 高 压 灭菌 2 h，破 坏其K抗 原，即为O抗 原，储存 于 4 备用。C.2 ExPEC 的O 抗原 玻片 凝集 试验 取O 抗 原分 别 与大 肠杆 菌 的O 抗 原 单因 子 血清 进行 玻片 凝 集 反应。即O抗 原和O 抗原
16、 单 因子 血 清各取15 L 在 玻片 上混 匀，2 min 内出 现明 显凝 集者 为 阳性反 应。同时 以O 抗原 与 0.5 石 炭酸 生理 盐水混合物 作对 照，观察 有无 自凝集 现象。玻片 凝集 试 验判定 标准 见 表C.1。表C.1 玻片凝 集试 验判 定标 准 反应强度 判断依据 对应结果+液体完全透明，出现大的凝集块 阳性+液体几乎完全透明，有明显凝集块 阳性+液体不甚透明，有可见凝集块 阳性+液体浑浊，有小的颗粒状物 阴性-液体浑浊，无凝集现象 阴性 C.3 ExPEC 的O 抗原 的试 管凝 集试验 经过玻 板凝 集试 验初 步筛 选可能 的O 血清 型，然后 通 过
17、试管 凝集 试验 确定 其O 血 清型。定型 标准 为血清的试 管凝 集价 1:640。其步 骤如 下：a)O 抗原 单因 子定 型血 清的 稀释：采取 倍比 稀释 法。取洁净 试管 8 支并 标记，每支 试管 用移 液器加入 0.5mL 0.5 石 炭酸生 理盐 水。用移 液器 吸取 1:10 稀释 的 大 肠杆 菌 抗 O 因子 血 清0.5 mL 加入 第1 管，在管 内反复 吹打 68 次，使 血清与 生理 盐水 充分 混合，然后 吸取 0.5 mL 加 入第2 管，同 样混 合 均匀后 吸取 0.5 mL 加入 第 3 管，重 复上 次操 作，直至 第 7 管，混匀后从 第7 管中
18、吸取 0.5 mL 弃去。第8 管 不加 血 清作为 对照。此 时从 第1 管到 第 7 管的血清稀释 倍数 分别 是1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280；b)加入抗 原：向各 支试 管中 分别加 入 0.5 mL O 抗原，此时 血清 稀释 倍数 相应 增大一 倍；c)抗原抗 体反 应：将 各管 混 合液震 荡摇 匀，置 于 37 水浴 锅 4 h 或 在室 温中 过夜，观 察结 果；d)结果判 定如下：1)生理盐 水对 照管 中的 抗原 应分散，无 凝集 块沉 淀，并呈混 浊悬 液；2)试验管 如有 凝集，管 底可 见到凝 集块，液 体上 部澄 清
19、、半 澄清 或混 浊度 降低，管底 凝集 块轻摇即 浮起，呈 片块 状；3)凝集强 弱判 断（以“”表 示）：确定 抗体 凝集 效价 时，应以 出现“”（50）凝集 现 象的最高 血清 稀释 度为 抗血 清的凝 集价；“”液体完全透明，100凝集，管底出 现大 片的伞状沉淀，震荡时呈 大片絮状，但可打 碎成 小絮 片状；“”液 体几 乎透 明，75 凝 集，管底 有明 显的 伞 状沉淀，震 荡时 呈 小 或大 絮片状；DB34/T 4203 2022 7“”液体 中等 混浊，50 凝集，管 底有 中等 量的 伞状沉 淀，震荡 时呈 小絮 片状；“”液 体透 明度 不明 显，25 凝 集，管底
20、有少 许不 明 显的伞 状沉 淀；“”抗 原抗 体不 凝集，液 体混浊、无透明 度，管底 无伞状 沉淀，但 由于 菌体 自然下 沉，管底中央 出现 圆点 状沉 淀，震荡时 呈均 匀混 浊状 态。DB34/T 4203 2022 8 附录D（资料 性）猪肠外 致病 性大 肠杆 菌系 统进化 群 PCR 鉴定 D.1 材料准 备 D.1.1 主要仪 器 PCR扩 增仪、1.5 mL 离 心 管、0.2 mL PCR 反 应管、水浴锅、高速 冷冻 离心 机、电 泳仪、凝 胶成 像系统、移 液器、移 液器 吸管。D.1.2 主要试 剂 2PCR Master Mix、超纯水、琼 脂糖、10mg/ML
21、溴 化 乙锭（EB）、TBE 缓 冲液、上样 缓冲 液（10Loading Buffer）、相对分 子质 量Marker（DL-2000）。D.1.3 引物序列 猪肠外 致病 性大 肠杆 菌系 统进化 群PCR 鉴 定用 引物 见 表D.1。表D.1 猪肠外 致病 性大 肠杆 菌系 统进化 群 PCR 鉴 定用 引物 检测基因 引物名称 引物序列（5-3）片段长度（bp）c h u A c h u A-F c h u A-R GACGAACCAACGGTCAGGAT TGCCGCCAGTACCAAAGACA 279 y ja A y ja A-F y ja A-R TGAAGTGTCAGGAG
22、ACGCTG ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC 211 T sp E4.C 2 T sp E4.C 2-F T sp E4.C 2-R GAGTAATGTCGGGGCATTCA CGCGCCAACAAAGTATTACG 152 D.2 操作步 骤 D.2.1 ExPEC 基因 组DNA 的提 取 采用煮 沸法。即 取 1 mL 培养 20 h 的 新鲜 菌液 加 入 1.5 mL 离 心管 中，以 12000 r/min 离心5 min，弃上 清液，加入 50 L 超 纯水 混均，置沸 水中 煮沸 10 min，之后 冰浴 5 min，再 煮沸 5 min，以 12000 r/min
23、 离心 5 min，取 上清 液即 为DNA模板。D.2.2 ExPEC 的系 统进 化群 分群 基 因PCR 扩增 D.2.2.1 检测过 程应 同时 做阳 性和 阴性空 白对 照。阳性 对照 模板 为 A、B1、B2、D 群 大 肠杆菌，阴 性 空白对照 为灭 菌超 纯水。D.2.2.2 PCR 反 应体 系：总体 积为 25 L，其中 含有 12.5 L 的 2Taq PCR Master Mix，10 mol/L上、下 游引 物各 1 L，1 g/L DNA 模板 2 L，灭 菌 超纯 水 8.5 L。D.2.2.3 PCR 反 应程 序：预变 性 94 5 min；变性 94 45
24、s，退 火 60 45 s，延 伸 72 50 s，循环 35 次；72 终延 伸 5 min。D.2.3 PCR 扩 增产 物电 泳检 测 DB34/T 4203 2022 9 D.2.3.1 用 100 mL 1TAE 缓冲 液 制备 1.0 琼 脂糖 凝胶，加入 5 L 10 mg/mL EB。D.2.3.2 取 5 L PCR 扩增 产物 与 1 L 10Loading Buffer 混合后 加入 点样 孔进 行电 泳，电 压 100 V，电 流 100 A，电 泳 30 min。用凝 胶成 像仪 观察、拍照、记录 电泳 结果。D.2.4 ExPEC 的系 统进 化群 分分 群 结果判 定 利用PCR 扩 增基 因chuA、yjaA 和DNA 片段TsqE4.C2 对ExPEC 进行 系统 进化 群划 分，主 要分为A群、B1 群、B2群和D群。大 肠杆 菌系 统 进化群 分类 见图D.1。ExPEC 系统进 化群 分群 基因PCR 扩 增结果 电泳 图见 图D.2。图D.1 大肠杆 菌 系 统进 化群 分类 图 标引序 号说 明：MMarker DL2000；1chuA；2yjaA；3TspE4.C2。图D.2 ExPEC 系统 进化 群分 群基 因 PCR 扩增 结果 M 1 2 3 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp
