1、 ICS 11.220 CCS B 41 34 安徽省地方标准 DB34/T 4204 2022 猪圆环病 毒 3 型套 式PCR 检 测技术规 程 Technical regulation for nested PCR detection method for porcine circovirus type 3 2022-06-29 发布 2022-07-29 实施 安徽省市 场监督 管 理局 发 布 DB34/T 42042022 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机
2、构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省动物疫病预防与控制中心提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽农业大学、合肥市动物疫病预防控制中心、萧县畜牧兽医水产服务中心、岳西县畜牧兽医水产服务中心、望江县畜牧兽医技术推广中心。本文件主要起草人：何长生、陈静、黄晓慧、王立、纵丰学、王南山、李少炎、王倩、沈艳、王维、范亚楠、苗文萍、陈曦、周迎春、王军、刘华、段倩倩、郑举、江定丰、沈岚、胡成威、朱良强、李郁。DB34/T 42042022 1 猪圆环病 毒 3 型 套式PCR 检测技 术规程 1 范围 本文件规定了猪圆环病毒病3型套式PCR检测方法的主要仪器设
3、备、试剂、引物、样品采集、运输与保存、样品处理、样品DNA提取、套式PCR扩增、结果判定、实验废弃物无害化处理、实验室分区、实验室生物安全管理要求。本文件适用于猪圆环病毒3型核酸套式PCR检测。2 规范性 引用 文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 病死
4、及病害动物无害化处理技术规范（农医发201725号）3 术语和 定义 下列术语和定义适用于本文件。猪圆环病毒3 型 porcine circovirus type 3，PCV3 猪圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，根据其致病性、抗原性及基因组序列分为1型、2型和3型等基因型，猪圆环病毒3型是2015年发现的新型圆环病毒亚型。4 主要仪 器设 备 PCR 仪。台式高速冷冻离心机：可控温至 4，离心力 12000 g 以上 全自动组织快速碾磨仪。涡旋振荡器 冰箱：28、-20、-70 三种。电泳仪。水平电泳槽。凝胶成像系统 可调微量移液器：最大量程分别为 10 L、50 L、100 L、1000
5、 L。高压蒸汽灭菌锅 DB34/T 42042022 2 电子天平：精确度 0.001 g。5 试剂 灭菌一级水：符合 GB/T 6682，121、20 min，高压蒸汽灭菌。DNA提取纯化试剂盒：商品化试剂。2Easy TaqSuper Mix：商品化试剂。0.5TBE缓冲液：称取 108g Tris、7.44 g 枸橼酸钠、55 g 硼酸，溶于 1000 mL 水中，配成 10TBE缓冲液备用。使用时，取 10TBE缓冲液 25 mL，加水 475 mL，制成 0.5 TBE 缓冲液。1琼脂糖：称取 1 g琼脂糖，溶于 100 mL 0.5 TBE 缓冲液中。磷酸盐缓冲液（PBS）：称取
6、8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于 800 mL 水中，用HCl调节溶液的pH值至 7.2，最后加水定容至 1 L，高压蒸气灭菌（121、至少 20 min），保存于室温或 4 冰箱中。无水乙醇：分析纯。DNA核酸染料：商品化试剂。DNA分子量标准：DL 2000 Marker，商品化试剂。阳性对照样品：70、30 min灭活的PCV3阳性病料上清。阴性对照样品：灭菌一级水。6 引物 引物序列见表1，委托有资质的公司进行合成。表1 猪圆环 病 毒3 型套式 PCR 扩增引 物 引物名称 引物序列 碱基数 扩增基因 扩增基因片段长
7、度 第1轮扩增上游引物（F1）5-CCACATGCGAGGGCGTTTAC-3 20 Cap 657 bp 第1轮扩增下游引物（R1）5-CCACAGCTGGCACATACTAC-3 20 第2轮扩增上游引物（F2）5-CTTTGGTGCCGTAGAAGTCTG-3 21 Cap 412 bp 第2轮扩增下游引物（R2）5-CGCCTAAACGAATGGGAAAC-3 20 7 样品的 采集、运 输与 保存 采集 按照 NY/T 541 的规定执行。病死猪无菌采集病淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织（5 g10 g），活猪采集EDTA抗凝全血（5 mL10 mL）装入抗凝采血管，粪便、口
8、鼻分泌物拭子和上述器官组织分别装入灭菌的 15 mL 样品保存管中（拭子样品在样品保存管中加入 5 mL 灭菌PBS），编号备用。运输与 保存 DB34/T 42042022 3 按照 NY/T 541 的规定执行。8 样品处 理 组织样 品 取样品约 1 g 放入 1.5 mL 离心管中，用手术剪剪碎，加入 1 mL PBS进行研磨（研磨管中加入23粒灭菌钢珠），制备组织匀浆，5000 g 离心 15 min，取上清液用于核酸提取。抗凝血 样品 直接用于核酸提取。粪便、口鼻 拭子 样品 充分震荡后，室温静置 5 min10 min，取上清 1 mL 加到 1.5 mL 灭菌离心管中，5000
9、 g 离心15 min，取上清液用于核酸提取。9 样品DNA 提取 采用商品化的DNA提取纯化试剂盒，按试剂盒说明书进行操作。也可采取酚氯仿法进行样品DNA提取（见附录A）。10 套式PCR 扩增 反应体 系配 制 按照表1配制反应体系，总反应体系体积为 20 L，配置表见表2。表2 PCV3 套式 PCR 扩增 体系 配 制表 第 1 轮扩增 第 2 轮扩增 组分 用量（L）组分 用量（L）F1/R1 各 0.5（10 mol/L）F2/R2 各 0.5（10 mol/L）2Easy TaqSuper Mix 10 2 Easy TaqSuper Mix 10 灭菌超纯水 8 灭菌超纯水 8
10、 DNA 模板 1 DNA 模板（第1 轮扩增产物 50倍稀释）1 总体积 20 总体积 20 DB34/T 42042022 4 反应条 件设 定 第1轮、第2轮PCR反应条件均为：95 预变性 5 min 后，35个循环扩增（95 变性 30 s、58退火30 s、72 延伸 30 s），最后 72 延伸 10 min，4 保存。每次PCR均应设一个阳性对照和阴性对照。电泳 将第2轮PCR扩增产物于 1 琼脂糖凝胶（在凝胶中加入DNA核酸染料）进行电泳，电压 100 V，时间 30 min40 min。结果观 察 用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。11 结果判 定 检测结 果成 立条 件
11、 阳性对照的PCR产物孔出现 412 bp 大小特异性目的条带，阴性对照PCR产物无目的条带，则检测结果成立（见附录B）；否则，结果不成立。结果判 定 11.2.1 结果阳 性 在试验成立的条件下，如果检测样品PCR产物电泳后出现 412 bp 大小特异性目的条带，判为阳性，则该样品为PCV3核酸阳性。11.2.2 结果阴 性 在试验成立的条件下，如果检测样品PCR产物电泳后未出现 412 bp 大小特异性目的条带，判为阴性，则该样品为PCV3核酸阴性。11.2.3 重新检 测 如果阳性对照无相应的目的条带，可能存在操作失误，则该检测需重新进行；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在
12、污染或操作失误，则该检测需重新进行。12 实验室 废弃 物无 害化 处理 病料的 无害 化处 理 按照病死及病害动物无害化处理技术规范的规定执行。实验废 弃物 处理 2 的84消毒液浸泡 30 min 后，放置于危险废弃物容器内暂存，委托有资质的固体废弃物无害化处理机构处置。DB34/T 42042022 5 13 实验室 分区 按照 SN/T 1193 的规定执行。14 实验室 生物 安全 管理 按照 GB 19489 的规定执行。DB34/T 42042022 6 附录A（资料 性）酚氯仿 法提 取样 品DNA A.1 取上清液或全血 500 L加入 10 十二烷基磺酸钠（SDS）溶液（S
13、DS 10 g、灭菌一级水 80 mL，用浓盐酸调 pH值至7.2，最后加灭菌一级水至 100 mL）50 L、20 mg/mL 蛋白酶K溶液（蛋白酶 K 100 mg、灭菌水 5 mL）10 L，于 55水浴 2 h3 h。A.2 加入 200 L Tris平衡酚，混匀，4、12000 g离心 15 min。A.3 取上清 500 L，加入 200 L Tris平衡酚和 200 L 氯仿，4、12000 g 离心 15 min。A.4 取上清 400 L，加入 200 L 氯仿，4、12000 g 离心 15 min。A.5 取上清 300 L，加入2倍体积的无水乙醇，-20 静置 20 min，4、12000 g 离心 15 min。A.6 弃上清，加入 1 mL 70 乙醇，冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。A.7 加入 20 L 灭菌一级水溶解沉淀，即用或-20 保存备用。DB34/T 42042022 7 附录B（资料 性）猪圆环 病 毒3 型PCR 产物 电泳图 见图B.1。标引序号说明：M DNA分子量标准（DL 2000 Marker）；1、2 阳性对照；3 阴性对照。图B.1 猪圆环 病 毒3 型 PCR 产物 电泳图 412 bp
