1、ICS 65.020.30 CCS B 41 33 浙江省地方标准 DB33/T 2492 2022 虾肝肠胞 虫核酸检 测技术规 范 Technical specification for nucleic acid detection of Enterocytozoon hepatopenaei 2022-05-17 发布 2022-06-17 实施 浙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB33/T 2492 2022 I 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB33/T 2492 2022 1 虾 肝肠胞 虫核酸检 测技术 规范 1 范围 Enterocytozoon hep
2、atopenaei EHP PCR PCR LAMP 2 规范性 引用 文件 SC/T 7103 3 术语和 定义 4 缩略语 Bst DNA DNA Bacillus stearothermophilus DNA polymerase bp base pair Ct cycle threshold DNA deoxyribo nucleic acid dNTP deoxy-ribonucleoside triphosphate EHP Enterocytozoon heppenatoaei LAMP Loop-mediated isothermal amplification PCR pol
3、ymerase chain reaction PEG polyethylene glycol SWP spore wall protein SYBR Green I qPCR Mix PCR 5 试剂和 材料 DB33/T 2492 2022 2 5.1 5.2 95%95 mL 100 mL 5.3 70%70 mL 100 mL 5.4 0.45 m 5.5 3%30.0 g pH 9.0 1 000 mL 15 min 5.6 16%PEG8 000 160.0 gPEG8 000 17.5 gNaCl 1 000 mL 15 min 5.7(Na2HPO4 0.2 mol/L 71.6
4、 gNa2HPO4 12H2O pH 9.0 1 000 mL 15 min 5.8 1 mL1 mol/L Tris HCl(pH8.0)20 mL0.5 mol/L EDTA(pH8.0)2 mL1 mg/mL RNA 5 mL10%SDS 100 mL 5.9 K 20 mg/mL-20 5.10 This 10 mol/L/25:24:1/24:1 5.11 TE 10 mL1 mol/L Tris HCl(pH8.0)2 mL0.5 mol/L EDTA pH8.0 1 000 mL 4 5.12 Taq DNA 5 U/L-20 5.13 10 PCR Taq DNA-20 5.1
5、4 MgCl2 25 mmol/L-20 5.15 dNTP dCTP dGTP dATP dTTP 10 mmol/L-20 5.16 PCR F514 R514 F147 R147 A A.1-20 5.17 1 TAE 242 gTris 100 mL0.5 mol/LEDTA(pH8.0)57.1 mL 1 000 mL 50 5.18 5.19 40 g 1 000 mL 0.25 g 4 5.20 4S Green 5.21 DNA Marker2 000-20 5.22 SYBR Green I qPCR Mix 5.23 PCR F118 R118 A A.2-20 5.24
6、10 thermolPol 200 mmol/L Tris HCl(pH8.0)100 mmol/L NH4 2SO4100 mmol/L KCl 20 mmol/L MgSO4 1%Triton X-100 5.25 5 mol/L 5.26 MgSO4 150 mmol/L 5.27 Bst DNA 8 5.28 LAMP F3 B3 FIP BIP FLP BLP A A.3-20 5.29 EHP DNA-20 5.30 EHP DNA-20 5.31 DB33/T 2492 2022 3 6 仪器和 设备 6.1 PCR 6.2 PCR 6.3 6.4 0 V 600 V 6.5 5
7、0 mL 500 mL 6.6 6.7 6.8 6.9-18 6.10 12 000 r/min 6.11 20 kHz 2 kHz 6.12 0.2 mL PCR 1.5 mL 2.0 mL 5.0 mL 6.13 1.5 mL 6.14 1 mg 6.15 7 样品采 集和 处理 7.1 样品的 采集 7.1.1 生物样 品 7.1.1.1 SC/T 7103 7.1.1.2 3 cm 95%-20 7.1.2 水样 500 mL-20 7.2 样品处 理 7.2.1 通用要 求 7.2.2 生物样 10 mg 100 mg 1.5 mL 7.2.3 水样 7.2.3.1 100 mL 0
8、.45 m 1.5 mL 3%2 mL 20 min 30 min 15 min DB33/T 2492 2022 4 7.2.3.2 5 mL 16%PEG8 000 pH 7.0 4 3 h 7.2.3.3 4 12 000 r/min 5 min Na2HPO 4 500 L 7.2.3.4 4 12 000 r/min 5 min 8 核酸抽 提 8.1 7.2 8.2 450 L K3 L 56 3 h 8.3 10 min 10 000 r/min 3 min 1.5 mL 8.4/25:24:1 10 min 10 000 r/min 1 min 1.5 mL 8.5/(24:1
9、)10 min 10 000 r/min 1 min 1.5 mL 8.6 100 L(-20-20 2 h 10 000 r/min 10 min 8.7 70%2 10 000 r/min 5 min 8.8 50 L 100 L DNA DNA TE 50 L 100 L-20 8.9 DNA DNA 9 PCR 检 测方 法 9.1 通用要 求 PCR PCR PCR B 9.2 套式PCR 9.2.1 第一 轮PCR 反应 9.2.1.1 PCR 0.2 mL PCR 10 PCR 2.5 L MgCl2 1.5 L dNTP 0.5 L F514 R514 1 L Taq 0.1
10、L DNA 1 L 25 L PCR PCR 9.2.1.2 PCR 95 5 min 95 30 s 58 30 s 68 45 s 30 68 5 min 4 9.2.2 第二 轮PCR 反应 9.2.2.1 PCR 0.2 mLPCR 10 PCR 2.5 L MgCl2 1.5 L dNTP 0.5 L F147 R147 1 L Taq 0.1 L 1 L 25 L PCR PCR 9.2.2.2 PCR 95 5 min 95 30 s 64 30 s 68 20 s 20 68 5 min 4 DB33/T 2492 2022 5 9.2.3 琼脂糖 凝胶 电泳 1 TAE 1.
11、5%1 g/mL 1 TAE 1 mm 2 mm PCR 6 L 2 L DNA 5 V/cm 30 min 1/2 2/3 9.2.4 结果判 定 9.2.4.1 PCR 514 bp/PCR 147 bp 9.2.4.2 PCR 514 bp/PCR 147 bp 9.2.4.3 PCR 514 bp PCR 147 bp 9.2.4.4 9.3 荧光定 量PCR 9.3.1 反应体 系 PCR 2 SYBR Green I qPCR Mix 10 L F118 R118 0.8 L DNA 1 L 20 L PCR PCR 9.3.2 反应条 件 95 30 s 95 5 s 60 30
12、 s 40 9.3.3 结果判 定 9.3.3.1 Ct 30 S Ct 30 S 9.3.3.2 Ct 30 S 9.3.3.3 Ct 35 S 9.3.3.4 Ct 30 Ct 35 9.4 LAMP 法 9.4.1 反应体 系 PCR 10 ThermoPol 2.5 L F3 B3 0.5 L FIP BIP 1 L FLP BLP 0.5 L dNTP4 L 4 L MgSO4 1 L Bst DNA 1 L DNA 2 L 25 L PCR PCR PCR SYBR 9.4.2 反应条 件 63 40 min 9.4.3 结果判 定 DB33/T 2492 2022 6 9.4.3
13、.1 S S 9.4.3.2 S 9.4.3.3 S 9.4.3.4 10 综合判 定 10.1 PCR PCR LAMP EHP 10.2 PCR PCR LAMP DB33/T 2492 2022 7 A A 附 录 A（资料 性）EHP 检 测方 法引 物序 列及 其在靶 基因 中的 位置 A.1 EHP套式PCR 引物 序列 及其 在靶基 因中 的位 置 A.1.1 套式PCR 引 物序 列 PCR A.1 表A.1 EHP 套式 PCR 引 物序 列 5 3 F514 TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT 10 mol/L 514 bp R514 CACGATGTGTCTT
14、TGCAATTTTC 10 mol/L F147 TTGGCGGCACAATTCTCAAACA 10 mol/L 147 bp R147 GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA 10 mol/L A.1.2 套式PCR 引 物在 靶基 因中 的 位置 PCR EHP A.1 图A.1 EHP 套式 PCR 引 物在 靶基 因中的 位置 A.2 EHP 荧 光定 量PCR 引物 序列 及其在 靶基 因中 的位 置 A.2.1 荧光定 量PCR 引 物序 列 PCR A.2 DB33/T 2492 2022 8 表A.2 EHP 荧 光定 量PCR 引 物序 列 5 3 F118 AC
15、AAAGTTACCAGAAGGTTATGAAG 10 mol/L 118 bp R118 TTGTGCCGCCAAACTCGTA 10 mol/L A.2.2 荧光定 量PCR 引 物在 靶基 因 中的位 置 PCR EHP A.2 图A.2 EHP 荧 光定 量PCR 引 物在 靶基因 中的 位置 A.3 EHP LAMP 引 物序 列及 其在 靶基因 中的 位置 A.3.1 LAMP 引 物序 列 LAMP A.3 表A.3 EHP LAMP 引物 序列 5 3 F3 TAGAAGATGCAAAGAGATATGTTGA 10 mol/L B3 GTTTGTCTCCAACTGTATTTGAA
16、A 10 mol/L FIP FIP1+FIP2 TTACTTAAACCCTTAACAACACTCTAAGTTACCAGAAGGTTATGAAGAA 40 mol/L BIP BIP1+BIP2 TTGGCGGCACAATTCTCAATGTCTGTGTAAATATCGTCTCTTT 40 mol/L FLP AACATTTAGTTCGTCACGCATTT 40 mol/L BLP TTCAAACACTGTAAACCTTAAAGCA 40 mol/L A.3.2 LAMP 引 物在 靶基 因中 的位 置 LAMP EHP A.3 DB33/T 2492 2022 9 图A.3 EHP LAMP 引物 在靶 基因 中 的位置 DB33/T 2492 2022 10 B B 附 录 B（规范 性）PCR 实 验室 分区 要求 B.1 区域划 分 PCR(),B.2 区域功 能及 要求 B.2.1 洁净区 PCR B.2.2 样品制 备区 PCR B.2.3 扩增区 PCR PCR B.2.4 扩增产 物分 析区 PCR B.3 注意事 项 _
