1、ICS 67.120.30 CCS B50 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/T 4234 2022 水产品中 副溶血性 弧菌检测 实时荧光 重组酶介导链 替换核酸 扩增法 Detection method for Vibrio parahaemolyticus in aquatic by real-time fluorescence recombinase-aid amplification 2022-03-18 发布 2022-04-18 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 4234 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.12020 标
2、准化 工作 导则 第1 部 分：标 准化 文件 的结 构和 起草规 则 的规 定起草。本 文件 由 南 京农 业大 学 提 出并归 口。本文件 起草 单位：南 京农 业大学、江 苏省 淡水 水产 研究所、上 海海 关动 植物 与食品 检测 中心、南 京市产品 质量 监督 检验 研究 院、广 东省 科学 院微 生物 研究所、杭 州傲 敏生 物科 技有限 公司。本文件 主要 起草 人：薛峰、朱晓 华、申进 玲、蒋原、张驰、薛 亮、汤芳、戴 建君、吴清 平、梁 莹、任建鸾、赵 凯颖、张 正荣。DB32/T 4234 2022 1 水产品中 副溶血 性 弧菌检测 实时荧光 重组酶介 导链替 换 核酸扩
3、增 法 1 范围 本 文 件 规 定 了 水 产 品 中 副 溶 血 性 弧 菌 检 测 实 时 荧 光 重 组 酶 介 导 链 替 换 核 酸 扩 增（recombinase-aid Amplification，RAA）法 的试 剂 材料、仪 器设 备、检测 程 序、操作 步骤、结果判 定 和报 告、检出 限 及防止污染 措施。本文件 适用 于水 产品 中副 溶血性 弧菌 检测。本 文件 适用 于水 产品 副溶 血性弧 菌的 快检 初筛。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期
4、对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 4789.7 食品 安全 国家 标准 食品 微生 物学 检验 副溶血 性弧 菌检 验 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 19489 实 验室 生物 安全通 用要 求 GB/T 27403 实 验室质 量 控制规 范 食品 分子 生物 学 检测 3 术语 和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 重组酶 介导 链替 换核 酸扩 增 recombinase-aid Amplification,RAA 一种利 用重 组酶、单链
5、 结 合蛋白 和DNA 聚 合酶 代替 了 传统PCR 的 热循 环解 链过 程，在 恒温 下（一 般为37 42），进行 核酸 扩增的 技术。4 原理 RAA 法 利用重 组酶、单 链结 合蛋白 和DNA 聚合 酶代 替了 传统PCR 的热 循环 解链 过程。根据 副溶 血性 弧菌的特 异性 基因 序列，结 合 荧光探 针检 测法 对 水 产养 殖及水 体 中 副溶 血性 弧菌 进行判 定。经实 时荧 光RAA扩增后，根 据样 品在30 min 内是 否出 现扩 增曲 线，可 判定样 品结 果。5 试剂材 料 除 另 有 规 定 外，试 剂 为分析 纯 或 生 化 试剂，实 验用水 符 合G
6、B/T 6682 的 要 求。所 有 试 剂 均 用无DNA酶污染 的容 器分 装。试剂 材料有：DB32/T 4234 2022 2 a)探针和 引物 根据副 溶血 性弧 菌的 特异 性基因 序列 设计 探针 和引 物。表1 副 溶血 性弧 菌探 针和 引物 致病菌种类 引物探针名称 序列（5-3）目的基因 副溶血性弧菌 上游引物tlh-F TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACG tlh 下游引物tlh-R AGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGA exo 探针tlh-P TTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTCFAM-
7、dTTHFABHQ-dTACAACCACACGAT-SpacerC3 b)试剂 1）RAA 反应 缓冲 液：20%PEG，280 mmol/L 醋酸 镁（MgAc2）。也可 采用 等效的 商品 试剂 盒。2）冻 干酶 制剂：1 mmol/L dNTP、90 ng/L 单链结合 蛋 白、120 ng/L recA 重 组酶、30 ng/L Bsu DNA聚合酶、30 ng/L ExoIII、100 mmol/L Tricine、20%PEG、5 mmol/L 二硫苏糖 醇、100 ng/L 肌酸激酶，保存 于 200 L 反应 管中。也可采 用等 效的 商品 试剂 盒。3）阳 性对 照：副溶 血
8、性 弧 菌标准 菌 株 ATCC17802，或 含目的 片段 的DNA；阴性 对 照：非 副溶 血性 弧菌标准 菌株，或 不含 目的 片段 的 DNA；空 白对 照：无菌水。6 仪器和 设备 包括以 下几 种：a)荧光检 测仪：带 有恒 温（39 1）扩 增功 能的 荧 光检测 仪。b)微量移 液器：0.1 L 2.5 L，1 L 10 L，2 L 20 L，10 L 100 L，20 L 200 L，100 L 1 000 L，并配 备 与移液 器匹 配的 吸头。c)高速台 式离 心机：离 心力 12000 g。d)恒温水 浴锅 或金 属浴：100 1。e)天平：感 量 0.01 g。7 检
9、测程 序 副溶血 性弧 菌实 时荧 光RAA 检 测程 序见 图。DB32/T 4234 2022 3 图 1 副溶 血性 弧菌 实时 荧光 RAA 检测 程序 8 操作步 骤 8.1 样品 处理 和增 菌 水产品 参照GB 4789.7 执 行。8.2 细菌 模板DNA 的制 备 8.2.1 试 剂盒 法 使用商 品化DNA 提 取试 剂 盒，吸 取适 量获 得的 增菌 液，按 其说 明提 取制 备模 板DNA。8.2.2 煮沸 法 8.2.2.1 吸取 10.1 获得 的增 菌液 1 mL 菌液加入 1.5 mL 离心管中，10000 g 离心 1 min，弃上 清。8.2.2.2 加入
10、1 mL 无菌水，充分 悬浮沉 淀，10000 g 离心 1 min，弃上清；8.2.2.3 加入 100 L 无菌水 混匀 后沸水 浴（或 95 金属 浴）10 min，置冰上 冷却；8.2.2.4 10000 g 离心 1 min，上 清液 即为 模板 DNA。8.3 实 时荧 光RAA 扩增 8.3.1 实时 荧 光RAA 反应 体系 副溶血 性弧菌 RAA 检测，50 L 反应体系 见表 2。DB32/T 4234 2022 4 表 2 副溶 血性 弧菌 荧光 RAA 反 应体 系 组分名称 体积（L）20%PEG 12.5 L tlh-F(10 mol/L)2.1 L tlh-R(1
11、0 mol/L)2.1 L tlh-P(10 mol/L)0.6 L DNA 模板（20 ng/L）4.0 L ddH2O 26.2 L MgAc2（280 mmol/L）2.5 L 总量 50 L 注：（1）DNA 模板量可根据 不同样品，具体情况进行调整。（2）将除MgAc2 和模板DNA 以外的所有 成分涡旋 混匀，分 装混合液至 含有冻干 酶制剂 的200 L 反应管中，轻柔手弹使冻干粉充分重溶均匀，短暂离心，打开反应单元，向每个反应单元的管盖上加入2.5 L MgAc2，然后向各反应单元加入适量模板DNA（100 ng），充分混匀并离心。（3）可使用等效的商品化荧光RAA 试剂盒按照
12、其说明书进行 检测。8.4 反应 条件 将反应 管置 于荧 光检 测仪 中，39 恒 温，30 min。在反应 过程 中实 时监 测荧 光信号。8.5 实验 对照 检 测过程 中分别 设阴性 对照、空白 对照和 阳性 对 照。空白对 照以无 菌水替 代模 板DNA；阴性对照以非副 溶血 性弧 菌 标 准菌 株DNA 作 为模 板DNA；阳 性对照 以 副 溶血 性弧 菌标 准菌株ATCC 17802 DNA作为模 板DNA。9 结果判 定和 报告 9.1 质控 标准 空白对 照在30 min 内无 扩 增曲线；阴 性对 照在30 min 内无 扩增 曲线；阳 性对 照 在10 min 内出 现
13、典 型的扩增 曲线。以上要 求需 在同 一次 实验 中同时 满足，否 则，本次 实验无 效，需重 新进 行。9.2 结果 判定 样品在30 min 内无扩 增曲 线，可 判定 样品 结果 为阴 性，可 直接 报告 未检 出副 溶血性 弧菌；样 品在30 min 内出现扩增 曲线，则 样 品结果 为副 溶血 性弧 菌初 筛阳性。对 于初 筛阳 性结 果，应 参见GB 4789.7 进行确证后 报告 结果。DB32/T 4234 2022 5 10 检出 限 本部分 所规 定方 法的 最低 检出限（LOD）为102CFU/mL。11 生物安 全措 施 按照GB 19489 规定 执行。12 防污染 措施 防止污 染措 施应 按照GB/T 27403 的规 定执 行。_
