1、 DB23 黑 龙 江 省 地 方 标 准 2022-08-22 发布 2022-09-21 实施 DB23/T 3318 2022 黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 元蘑液体 菌种生 产技 术规程 ICS 65.020.01 CCS B 05 DB23/T 3318 2022 I 前 言 本文件按照GB/T 1.1 2020 标准化工 作导则 第1部 分：标准化 文件的结 构和起草 规则 的 规定起草。请注意本文 件的某些 内容可能 涉及专利。本文件 的发 布机构不承 担识别这 些专利的 责任。本文件由黑 龙江省林 业和 草原 局 提出。本文件起草 单位：哈 尔滨学院、哈
2、尔滨 职业技术 学院、鹤岗市十 八号林场、绥棱具 国有林场 三吉台林场、逊克 县林业工 作总站、黑龙江省 知识产权 保护 中心。本文件主要 起草人：孙婷 婷、刘瑞鹏、高静波、赵 妍、李贵军、杜鹏禹、张春红、刘增 才、李亚伟、耿楠楠。DB23/T 3318 2022 1 元蘑液体 菌种生 产技术 规程 1 范围 本文件规定 了 元蘑（Hohenbuehelia serotina）液体 菌种生产的 环境条件 要求、生 产车间的 设计、生产 仪器和 设备、菌种选择、母 种制备、摇瓶液 体种 制备、发 酵罐空消、制备 发酵罐 液体种培 养基、发酵罐液体种 的接种、发酵罐液 体种培养 条件、发 酵罐 液
3、体种检测、发酵罐 液体种质 量要求和 生产档案。本文件适用 于 元蘑液 体菌种生产。2 规范性引 用文件 下列文件 中 的内容通 过文中的 规范性引 用而构成 本文 件必不可少 的条款。其中，注日 期的引用 文件，仅 该 日期对应 的版本 适用于本 文件；不 注日期的 引用 文件，其最 新版本（包括所有 的修改单）适用于 本文件。GB/T 150.1 压力容 器 第1 部分：通 用要求 GB/T 1921 工业蒸汽 锅炉 参 数系列 GB 5749 生 活饮用水 卫生标准 GB/T 11165 实验室pH 计 GB/T 13554 高效空 气过滤器 GB 19153 容积式空 气压缩机 能效限
4、定 值及能效 等级 GB 50073 洁净厂房 设计规范 NY/T 528 食用菌菌 种生产技 术规程 3 术语和定 义 本文件没有 需要界定 的术语和 定义。4 环境条件 要求 应符合 NY/T 528 的 规定。5 生产车间 的设计 应符合 GB 50073 的 规定。6 生产仪器 和设备 生产仪器设 备要求如 下：a）液体种发 酵罐质量 应符合 GB 150.1 的规定；b）空气压缩 机质量应 符合 GB 19153 的 规定；c）空气过滤 器质量应 符合 GB/T 13554 的规定；DB23/T 3318 2022 2 d）pH 计质量 应符合 GB/T 11165 的规定；e)蒸汽
5、锅炉 质量应符 合 GB/T 1921 的规 定；f）超净工作 台、高压 蒸汽灭菌 锅、恒温 培养箱、恒 温振荡培养 箱、冰箱、显微镜、液体菌 种接种枪、磅秤、天平 应符 合 NY/T 528 的规 定。7 菌种选择 选择菌丝生 长健壮、产量高、抗逆性强、抗杂菌 能力 强的菌种。8 母种制备 8.1 母种培 养基 的制作 制作马铃薯 葡萄糖琼 脂培养基（PDA），装入 试管（18 mm 180 mm 或 20 mm 200 mm）中，分装量应为 试管长度 的 1/51/4，应使 用棉塞或 硅胶 塞封口，其 中 棉塞应 使用梳棉，不应使 用脱脂棉。将试管 放入 高压蒸汽 灭菌锅中，在0.105
6、Mpa 0.125 Mpa 下灭菌30 min。灭菌后 摆放成的 斜面培养 基顶端应距试 管口 50 mm。8.2 接种与 培养 在无菌条件 下，用接 种钩取黄 豆粒大小 的初始菌 种接 种在母种培 养基上。母种培养 的温度应 为22 1，空 气相对湿 度控制在65%75%，通风、避光 培养8 d10 d。9 摇瓶液体 种制备 9.1 摇 瓶液 体种 培养 基配方 推荐培养基 配方：葡 萄糖 20 g、玉米粉 10 g、酵母 粉 5 g、蛋白 胨 3 g、磷 酸二氢钾2 g、硫酸 镁1 g、水 1000 mL。水 的质量应 符合 GB 5749 的 规定。9.2 摇 瓶液 体种 培养 基的制作
7、、灭菌 将配方中的 原料充分 混合均匀，装入500 mL 或 1000 mL、耐 126 高 温、无色 或近无色 的玻璃三角瓶中，装液量 宜为三角 瓶体积 的 1/4，用16 cm 16 cm 聚乙烯 透气封瓶 膜封口。在 0.105 Mpa 0.125 Mpa 下灭菌 30 min。9.3 摇 瓶液 体种 的接 种 与培养 在无菌条件 下，用接 种铲将 1/41/3 的斜面母 种接 入摇瓶液体 培养基中，置于恒 温振荡培 养箱，在 22 以 140 r/min 振荡培 养 5 d7 d。10 发酵罐 空消 发酵罐初次 使用，或 出现染菌，或长期 放置时，应检 查发酵罐上 全部阀门 和压力表，
8、进行空 消。空消时罐内蒸 汽压力应 控制在 0.105 Mpa 0.125 Mpa、温度应控制 在 121 124 灭菌 40 min。11 制备发 酵罐液体 种培养基 DB23/T 3318 2022 3 11.1 发酵 罐 液体 种 培养基配 方 在9.1 配方的 基础上应 加入2.9 mL/L的消 泡剂（如豆 油）。11.2 初始 pH 值 pH 值为5.5 6.0。11.3 投料 与定容 将 11.1 中的 原料按比 例充分混 合均匀，倒入发 酵罐 中，加水定 容至罐体 总容积的65%70%，拧紧上料口盖。11.4 灭菌 液体 种 发酵 罐内蒸汽 压力控制 在 0.105 Mpa 0.
9、125 Mpa，温度控制 在 121 124 灭菌 40 min。11.5 冷却 灭菌结束后 应将冷水 通入发酵 罐夹层或 者内置冷 却系 统中循环，使培养基 降温至 22 24。降温过程中 应及时向 发酵罐内 通入 无菌 风。12 发酵罐 液体种的 接种 用带有手柄 的内径略 大于接种 口的铁丝 圈缠绕纱 布，蘸上 95%的酒 精，套 在接种口 上点燃。打开摇瓶液体种封 瓶膜，用 火焰灼烧 瓶口 30 s 40 s，打开 接 种口盖，将摇瓶液 体种迅速 倒入罐中，接种量为培养基体 积的 0.1%0.2%。迅速盖好 接种口，拧紧。13 发酵罐 液体种培 养条件 13.1 通气 量 每升发酵液
10、宜 通入无 菌空气 0.04 m3/h 0.06 m3/h。13.2 罐压 保持在 0.03 Mpa0.05 Mpa。13.3 培养 温度 宜控制在 22 1。13.4 培养 时间 宜控制在 5 d 7 d。14 发酵罐 液体种检 测 14.1 取样 接种 2 d 后进 行检测，用 酒精火焰 灼烧取样 阀 30 s 40 s，弃掉最初 流出的少 量液体种，取 30 mLDB23/T 3318 2022 4 50 mL 液体种 放入无 菌 150 mL 三角瓶中，塞紧棉 塞。取样后应用 酒精火焰 把取样阀 烧干。14.2 检测 对 14.1 所取 样品在 PDA 平板培 养基上画 线培养，在 2
11、2 1 下培养2 d3 d，每天观察 菌落生长情况，若 PDA 平 板培养基 上没有杂 菌生长，则表 明菌种合格。用显微 镜检测菌 丝生长发 育状态。15 发酵罐 液体种质 量要求 15.1 感官 指标 应符合表 1 的要求。表1 发酵罐 液体种感 官指标 项 目 指 标 菌液 色泽 球状 菌丝 体呈 乳白 色，滤液 呈黄 棕色 菌液 形态 菌液 澄清 透明 不浑 浊，稍粘 稠，有大 量球 状菌 丝体 悬浮、分 布 均匀、不 迅速 分层 菌液 气味 有元 蘑菌 种培 养时 特有 的香 味，无异 味，发酵 罐排 气口 气味 正 常 15.2 理化 指标 应符合表 2 的要求。表2 发酵罐 液体种理 化指标 项 目 指 标 pH 值 3.55.5 菌丝 湿重（g100 mL）5 显微 镜下 菌丝 形态 菌丝 粗壮，有 球状 和丛 状菌 丝，分布 均匀 样品 无菌 检查 有元 蘑菌 丝生 长，无霉 菌、酵母 菌、细菌 等杂 菌生 长 16 生产档 案 应建立生产 档案，内 容包括：环 境条件 要 求、生 产车 间的设计、生产仪 器和设备、菌 种选择、母种制备、摇瓶 液体种制 备、发酵 罐空消、制备发酵 罐液 体种培养基、发酵罐 液体种的 接种、发 酵罐液体 种培养条件、发酵罐液 体种检测、发酵罐 液体种质 量要 求 等。
