1、ICS 65.020.01 CCS B 10 DB23 黑龙江省地方标准 DB23/T 3237 2022 黑土耕地土壤微生物肥力评价技术规范 2022-07-07 发布 2022-08-06 实施 黑龙江省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB23/T 32372022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部 分：标准 化文件 的结 构和 起草规 则 的规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本 文件 由黑 龙江 省农 业农 村厅提 出。本文件 起草 单位：黑 龙江 省 农
2、业 科学 院土 壤肥 料 与 环境资 源研 究所 和哈 尔滨 芮 煊科 技有 限公 司。本 文件 主要 起草 人：王爽、孙磊、赵 文博、金 品娇、高中 超、刘凯、李 伟群、郝小 雨。DB23/T 32372022 1 黑 土耕地 土壤 微生 物肥力 评价技术 规范 1 范围 本 文件 规定 了土壤 微 生物 肥力 的 术语 和定 义、土壤 样品的 采集 与预 处理、土 壤微生 物肥 力评 价项 目及测定 和黑 土耕 地微 生物 肥力评 价方 法。本 文件 适用 于 黑 土耕 地土 壤微生 物肥 力的 评价。2 规 范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范 性 引用 而构 成
3、本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 20287-2006 农 用微 生 物菌剂 GB/T 32723 土 壤微 生物 生物量 的测 定 底物 诱导 呼吸法 GB/T 33469-2016 耕地 质 量等级 NY/T 52-1987 土壤 水分 测定法 NY/T 1121.1-2006 土壤 检测 第1 部分：土 壤样 品 的采集、处 理和 贮存 LY/T 1220 森 林土 壤呼 吸 强度的 测定 3 术 语 和 定义 下 列术 语和
4、 定义 适用 于本 文件。3.1 土壤微 生物 肥力 是指 土 壤中 的微 生物 通过 其活动 与代 谢能 够对 土壤 的物理 和化 学性 质产 生积 极作用，并 为 植 物根 系提供营 养的 能力。4 土壤 样品 的 采集 与预 处 理 4.1 采样 单元 确定 根据所 评价 耕地 受自 然因 素及人 为因 素 对 土壤 微生 态系统 影响 的需 要，按 地 形特点、成土 母质、土地利用 方式、覆 被变 化、气候条 件、耕作 以及 施肥 方式 等 分为 若干 个采 样单 元。4.2 采样 时间 土壤样 品野外 采 集时 间 为7 月-8 月，应根 据区 域天 气和农 业管 理条 件的 变化，
5、避开 降雨 等天 气、以及施 肥和 灌溉 等管 理时 期。4.3 采样 方法 DB23/T 32372022 2 同一采 样单 元内 按照“随 机”、“等 量”和“多点 混合”原则。用 GPS 定位 仪确定 采样 地点 的地 理位置（经纬 度），每 个样 地按照“五 点梅 花式”采 集。采 集深 度 为0 cm 20 cm 土 层，挖掘 时去 掉地 表大块沙 石和 其他 杂物，用 酒精消 毒过 的干 净铁 锹或 小铲沿 土壤 剖面 向下 挖，五点混 合后 为一 个样 地 的 代表样品，以 1kg 左右 为宜，按照 NY/Y 1121.1 中 2.2 耕层 混合 土样 的采 集中 规定的“四 分
6、法”弃 去 多余土样，保 留 300 g 500 g，放入 无 菌袋 中并 在袋 上 写清 采样 编号 后立 即放 于 4 冷 藏箱 或者 冰袋 中保存，尽快 运 回 实验 室。每个采 样单 元不 少 于 10 个 样地。4.4 土壤 样品 保存 将土样 及时 带 回 实验 室后 除去土 壤中 可见 的动 植物 残体，一部 分 新 鲜土 样保 藏于 4，在 一周 内完成可 培养 微生 物数 量、酶活性、微 生物 量碳 和氮 的测定，另 一部 分 土 样风 干后过 2 mm 筛，用 于土 壤有机质 含量 的测 定。4.5 土壤 含水 量和 有机 碳 的测定 土壤含 水量 的测 定按照NY/T 5
7、2-1987 的规定 进行，土 壤有机 碳的 测定 按照GB/T 33469-2016 中附 录C的规定 进行。5 土壤 微 生物 肥力 评价 项目 及测定 5.1 土壤 微生 物肥 力评 价 项目 土壤微 生物肥 力评价 项目 建立 按 特尔斐 法，参见附录A。具体 评价 项目 包括 微 生物数 量（可 培养 细菌数量、放线 菌、真 菌数 量）、微生 物生 物量（微 生物生 物量 碳 和 氮）、土 壤酶活 性（纤 维素 酶、蔗 糖酶、脲 酶、碱性 磷酸 酶、过氧化 氢酶）和 微生 物活 性（微 生物 熵），其中 微 生物 熵 计算 如公式（1）：式中：qSMBC 微生物 熵；Cmic 微生物
8、 量碳；Corg 土壤有 机碳。5.2 评价 项目 的测定 5.2.1 微 生物 数量 测定 土壤可 培养 细菌、真 菌和 放线菌 数量 采用 平板 计数 法，按照GB 20287-2006 中6.3.2的 规定 进 行，所用培养 基及其 配制 方法分 别按照GB 20287-2006 的附录A中A.1、A.6 和A.7规定 进行，换算成 每克 干土 中所含的 菌落 数。5.2.2 微 生物 生物 量测定 土壤 微 生物 生物 量 测 定应 按照GB/T 32723 的规 定进 行。5.2.3 土 壤酶 活性 测定 5.2.3.1 纤维 素酶 活性 纤维素 酶活 性测 定 应 按照GB 202
9、87-2006 的 附录D 中D.1的规 定进 行。qSMBC=C mic/C org.（1）DB23/T 32372022 3 5.2.3.2 蔗糖 酶活性 蔗糖酶 活性 以 蔗糖 为底物，采用 3,5-二硝基 水杨 酸 比色法 测定，具体 方法按 附录B中B.1的 规定 进行。5.2.3.3 碱性 磷酸 酶活 性 碱性 磷 酸酶 活性 测定 采用 磷酸苯 二钠 比色 法，具体 方法按 附录B中B.2的 规定 进行。5.2.3.4 脲酶 活性 脲酶活 性以 尿素 为底 物，采取苯 酚 次氯 酸钠 比色 法 测定，具体 方法 按附 录B 中B.3的 规定 进行。5.2.3.5 过氧 化氢 酶活
10、 性 过氧化 氢酶 采用 高锰 酸钾 滴定法 测定，具 体方 法按 附录B 中B.4 的规 定进 行。5.2.3.6 土壤 呼吸 强度 的 测定 土 壤呼 吸强 度测 定应 按照LY/T 1220 的规 定进 行。6 黑 土耕 地微 生物 肥力 评价 方法 6.1 土壤 微生 物肥 力指 数 模型 采用主 成分 分析 法确 定单 向评价 因子 的权 重值Ki。根据作 用效 应曲 线，建立 隶属度 函数，计 算各 评价因子 的隶 属度 值Ci。利 用模糊 数学 中加 权和 法建 立土壤 微生 物肥 力指 数模 型，将 所选 的单 个因子 的评价结果 转换 为由 各评 价 因 子构成 的土 壤微
11、生物 肥力 综合评 价。土壤 微生 物肥 力指数 模型 如 公 式（2）：BIF=式中：BIF 土壤微 生物 肥力 综合 指数；c i 各个评 价因子 的 隶属 度值；k i 第i个 评价 因子 的权 重；n 评价因子 的 个数。6.2 单因 素评 价 6.2.1 单 因素 评价 模型 的 选择 土壤 可 培养 微生 物数量、微生物 生物 量碳、氮、微 生物 熵 及酶 活性 均属 于S 型 隶属函 数，各 评价 因素的 隶 属函 数可 简化 为公 式（3）：f(x)=式中：f(x)隶属函 数；n i=1(ki)ci.（2）1 x（3）x 0 x x0 xx0 DB23/T 32372022 4
12、 x 评价因 素；x 0 评价因 素 的 上临 界值。6.2.2 隶 属函 数阈 值上 限 的确定 采用累 积频率 曲线 进行确 定 隶属 函数阈 值上 限，一 组样本x1,x2,.xn，给定 某一阈 值x0，不大 于x0的样 本数 为m，则称m/n 为不大 于x0 的累 积频 率，计算就 得到 累积 频率 曲线。以 所有 被测 指标 数据 累 积频率为75%的指 标值 作为 隶 属函数 的阈 值上 限。6.3 评价 项目 的权 重 参照 表1 规 定的 层次 分析 法，建 立目 标层、准 则层（微生 物数 量、活性 和微 生物生 物量）和 评价 项目层层 次结 构，构 建判 断 矩阵。经 层
13、次 单排 序及 其 一致性 检验，计算 并确 定 所有 评 价项 目 对 黑土 耕地 微生物肥 力（目标 层）相对 重要性 的排 序权 重值。表1 黑 土耕 地土壤 微 生物 肥力评 价因 子总 集 目标层 黑土耕 地土壤 微 生物 肥力 评价 准则层 指标层 准则层 指标层 微生物 数量 指标 可培养 细菌 数量 土壤酶 活性 指标 蔗糖酶 可培养 放线 菌数 量 纤维素 酶 可培养 真菌 数量 脲酶 微生物 生 物 量指 标 微生物 生物 量碳 碱性磷 酸酶 微生物 生物 量氮 过氧化 氢酶 微生物 活性 指标 微生物 熵 土壤呼 吸强 度 6.4 土壤 微生 物肥 力 综 合 评价 根据
14、6.2.2确 定的 阈值上 限，利用 公式（3）计算 各 个 土壤样 品 的隶 属度 值。然 后应用 公式（2）中所建立 的土 壤生 物肥 力指 数模型，计 算不 同 土 壤样 本 的BIF 值，其 值在0 1 之间。BIF 值 越大，黑 土耕 地微生物 肥力 水平 越高。DB23/T 32372022 5 附录A（资料 性附 录）特尔斐 法 A.1 特尔 斐法 的 基 本原 理 该方法 的核 心是 充分 发挥 一组专 家对 问题 的各 自独 立看法，然 后归 纳、反馈，逐步 收缩、集 中，最终产生 评价 与判 断。A.2 特尔 斐法 的基 本步 骤 特尔斐 法的 基本 步骤 见图1。图A.1
15、 特尔 斐法 基本 步骤 A.2.1 列出 的调 查提纲 应 当用词 准确，层次 分明，集中于 要判断 和评 价的问 题。为 了 使专 家易 于回答问题，通常 还在 提出 调查 提纲的 同时 提供 有关 背景 材料。A.2.2 为了 取得 较好的 评 价结果，通常 需要 选择对 问题了 解校对 的专 家10人50 人，少数 重大 问题 可选择100 人 以上。A.2.3 调查 结果 的归纳、反馈和 总结。收集 到专家 对问题 的判断 后应 做统一 归纳。定量判断 的 归纳 结果通常 符合正 态分 布。这 时 可在 仔细听 取 了 持极端 意见 专 家的理 由后，去掉 两段各25%的 意见，寻找
16、 出建议最 集中 的范 围，然 后 把归纳 结果 反馈 给专 家，让专家 在此 提出 自己 的评 价和判 断。这 样反 复3 次5次后，专家 的意 见会 逐步 趋近一 致。这时 可作 出 最 后的分 析报 告。A.2.4 统 计参 数。时常 用 到算数 平均 数和 变异 系数。设 专家i 对第j 项调 查的 评定为Cij，则第j项 评价 的算数平均值为mj=Cij/n,式中n为专家总数；第j项评价的表一系数为V=Sj/mj，其中Sj 为Cij 的标准差，mj为均值。选择解 答专 家 分别征 询每 个专 家对问题 的见 解 归纳统 计 权重确 定 反馈 3 5 次 最终总 结分 析 YES 重新
17、赋 值 意见反 馈 DB23/T 32372022 6 附录B（规范 性）土壤酶 活性 测定 B.1 土壤 蔗糖 酶测定 B.1.1 试 剂配 制 a）酶 促反 应试 剂：基质8%蔗糖（m:v=8:100）。b）pH 5.5 磷酸 缓冲 液：1/15 M 磷酸 氢二 钠（23.876 g Na2HPO4 12H2O 溶于 1 L 蒸馏 水中）50 mL加1/15 M 磷酸 二氢 钾（9.073 g KH2PO4 溶于1 L 蒸馏 水中）950 mL。c）葡 萄糖 标准 液（1 mg/mL）：预先 将分 析纯 葡萄 糖 置 80 烘 箱 约 12 h。准 确称 取 500 mg 葡萄糖于烧 杯中
18、，用 蒸馏 水溶 解后，移至 50 mL 容量 瓶 中，定 容，摇 匀（4 保 存一周）。若 该溶 液发 生 浑浊或出 现絮 状物，则 应弃 之，重 新配 制。d）3,5-二 硝基 水杨 酸试 剂（DNS 试剂）：称2.5 g 二 硝基水 杨酸，溶 于100 mL 2 mol/L NaOH（20 g 定容250 mL）和 250 mL 水中，再 加150 g 酒石 酸 钾钠，用水 稀释 定容 至500 mL（棕色瓶 保存，保 存期不超 过一 周）。B.1.2 标 准曲 线绘 制 分 别吸1 mg/mL 的葡 萄糖标 准液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于试 管中，加 DNS
19、 试剂 3 mL 混匀，于 沸水 浴中 准确反应 5 min（从 试管 放入 重新 沸 腾时计 算起），取出 立即 冷水浴 中冷 却至 室温，于50 mL 容量 瓶定 容后 以空 白 管调零 在波 长508 nm 处 比 色，以 OD 值为 纵坐 标，以 葡萄糖 浓度 为横 坐标 绘制标准 曲线。B.1.3 土 壤蔗 糖酶 测定 称取5 g 土 壤，置 于 50 mL 三角 瓶，注 入15 mL 蔗 糖溶液，5 mL pH 5.5 磷 酸 缓冲液 和 5 滴甲 苯。摇匀混 合物 后（160 r 震荡 10 min），放 入37 恒温箱 中培养 24 h。按 此 操作，每一 土样 需做 无基 质
20、对照，即 用 15 mL 蒸 馏水 代替 15 mL 基质（8%蔗糖 溶液）；整 个试 验 需 做无 土壤对 照，即 用 5 mL 蒸馏水代 替5 g 土 壤，每批 土 样做 2 个。培养 结束 后用 滤纸 迅 速过 滤。取1 mL 滤 液，注 入 50 mL 容 量瓶 中，加3 mL DNS 试 剂，并在 沸 腾的水 浴锅 中加 热 5 min，随即将 容量 瓶移 至自 来水 流下冷 却 3 min。溶 液因生成3-氨基-5-硝基 水杨 酸而呈 橙黄 色，最后 用蒸 馏水稀 释 至 50 mL，并在 分 光光度 计上 于 508 nm 处进行比色（如 果样 品吸 光值 超过标 曲的 最大 值
21、，则应 增加分 取倍 数或 减少 培养 的土样）。B.1.4 结 果计 算 蔗糖酶 活性 以24 h、1 g 干土生 成葡 萄糖 毫克 数表 示为公 式（B.1）：蔗糖酶 活性=（a 样品-a 无土-a 无基 质）n/m 式中：a样品 由标准 曲线 求得 的葡 萄糖mg 数 a无土 由标准 曲线 求得 的葡 萄糖mg 数 a无基质 由标准 曲线 求得 的葡 萄糖mg 数 n 分取倍 数 m 烘干土 重（B.1）DB23/T 32372022 7 B.2 碱性 磷酸 酶 B.2.1 试 剂配 制 a）0.5%磷 酸苯 二钠（用pH 9.4 硼酸 盐 缓 冲液 配制）；b）甲 苯；c）0.3%硫
22、酸铝 溶液。d）pH 5 醋 酸盐 缓冲 液；e）氯 代二 溴对 苯 醌 亚胺 试 剂：取 0.125 g 2,6-二 溴 苯醌氯 酰亚 胺，用 10 mL 96%乙 醇溶 解，存于棕色瓶 中，放 于4 冰 箱，保存 的黄 色溶 液未 变褐 色之前 均可 使用。f）酚 标准 溶液：酚原液 取1 g 重 蒸酚 溶于蒸 馏水 中，稀释 至 1 L，存于 棕色 瓶中；酚 工作 液 取 10 mL 酚原液稀释 至1 L（每 mL 含0.01 mg 酚）。B.2.2 酚 标准 曲线 绘制 取1、3、5、7、9、11 和13 mL 酚 工作 液，置于 50 mL 容量 瓶中，每 瓶加5 mL 缓冲液 和4
23、 滴 氯代二溴对苯 醌亚 胺 试剂，显 色后稀释 至刻 度，即 得 0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026 mg/g 浓度 的酚 标准溶 液梯 度。30 min 后 比色测 定，绘制 标准 曲线。B.2.3 土 壤碱 性磷 酸酶 的 测定 称取 5 g 风 干土 置 于200 mL 三 角瓶 中，加2.5 mL 甲 苯，轻摇15 min 后，加 入 20 mL 0.5%磷酸 苯二钠，摇匀 后放 入37 恒温箱 培 养 24 h。培养 后 向培养 液中 加 100 mL 0.3%硫酸铝 溶液 并过 滤。吸取3 mL 滤液 于50 mL 容
24、量 瓶 中，按 绘制 标准 曲线 所述 方法显 色，在分 光光 度计 上于 660 nm 处 比色。土壤碱性磷 酸酶 活性 以37 下 24 h 后1 g 土壤 中所 释 放的酚 的 mg 数 表示。B.3 脲酶 B.3.1 试 剂配 制 a）甲苯。b）10%尿素（m:v=1:10）。c）柠 檬酸 盐缓 冲液：184 g 柠檬 酸 和 147.5 g KOH 溶于蒸 馏水。将 两溶 液合 并，用 1 mol/L NaOH将pH 调至6.7，用 水稀 释 定容 至 1000 mL。d）苯 酚钠 溶液（1.35 mol/L）：62.5 g 苯 酚溶 于少 量乙醇，加 2 mL 甲醇 和 18.5
25、mL 丙酮，用 乙醇稀释 至100 mL（A 液）；27 g NaOH 溶于 100 mL 水（B 液）。将A、B 溶 液 保存 于 4 冰 箱中，使 用前各 取20 mL 混 合，用蒸 馏水稀 释 至 100 mL。e）次 氯酸 钠溶 液：用水 稀 释次氯 酸钠 试剂，至 活性 氯的浓 度 为0.9%，溶液 稳 定。f）氮 的标 准溶 液：精确 称 取 0.4717 g 硫酸 铵溶 于水 并稀释 至 1000 mL，得 到 1 mL 含有 0.1 mg 氮的标准 液；再将 此液 稀 释10 倍（吸 取10 mL 标准 液 定容 至 100 mL）制 成氮 的 工作液（0.01 mg/mL）。
26、B.3.2 标 准曲 线制 作 分别取 0、1、3、5、7、9、11、13 mL 氮工 作液，移 于 50 mL 容 量瓶 中，然后补 加蒸 馏水 至 20 mL。再加 入4 mL 苯 酚钠 溶液 和3 mL 次氯 酸钠 溶液，随 加 随摇匀。20 min 后 显色，定容。1 h 内在 分光 光度计于578 nm 波 长处 比色。然后以 氮工 作液 浓度 为橫 坐标，吸光 值为 纵坐 标，绘制标 准曲 线。B.3.3 土 壤脲 酶的 测定 DB23/T 32372022 8 称取 5 g 土样于 50 mL 三 角瓶中，加1 mL 甲 苯，振 荡均匀，15 min 后加 10 mL 10%尿素
27、 溶液 和20 mL pH 6.7 柠檬 酸盐 缓冲 液，摇 匀后 再 37 恒温 箱培养 24 h。培 养结 束后 过滤，过滤 后取 1 mL 滤液加入 50 mL 容量 瓶中，再 加 4 mL 苯酚 钠溶 液 和 3 mL 次 氯酸 钠溶 液，随加 随 摇匀。20 min 后显 色，定容。1 h 内 在分 光光 度计于 578 nm 波长 处比 色（靛 酚的蓝 色 在1 h 内保 持稳 定）。注意事 项：每 个样 品应 做 一个无 基质 对照，即以 等 体积的 蒸馏 水代 替基 质，其他操 作与 样品 实验 相同；整 个实 验设 置一 个无 土对照，即 不加 土样，其 他操作 与样 品实
28、验相 同；如果样 品吸 光值 超过 标 曲 的最大值，则 应该 增加 分取 倍数或 者减 少培 养的 土样。B.3.4 结 果计 算 土壤脲 酶活 性（Ure）以24 h 后1 g 土壤 中NH3-N 的 mg 数表 示 为 公式B.2：Ure=（a 样品-a 无土-a 无 基质）V n/m 式中：a样品 样品吸 光值 由标 准曲 线求 得NH3-N的mg 数 a无土 无土对 照吸 光值 由标 准曲 线求得 的NH3-N 的mg 数 a无基质 无基质 对照 吸光 值由 标准 曲线求 得的NH3-N的mg 数 V 显色液 体积 n 分取倍 数 m 烘干土 重 B.4 过氧 化氢 酶 B.4.1
29、试 剂配 制 a）0.3%过 氧化 氢溶 液：2.5 mL 30%过 氧化 氢溶 液定 容至 250 mL。b）1.5 mol/L 硫酸 溶液：42 mL 定容 至500 mL。c）饱 和明 矾：20 时的 溶解度 为 10.84 g，30 时的溶 解度 为15.41 g。d）0.02 mol/L 高锰 酸钾 溶液：称 取 3.16 g 高锰 酸 钾定容 至 1 L，其准 确浓 度用标 准草 酸钠 标定。B.4.2 测 定步 骤 称取土 样 2.00 g 于 100 mL 塑料 瓶，加 40 mL 蒸 馏 水，加 入 50 mL 0.3%的 过 氧化氢 溶液，200 r振荡20 min。取下
30、后立 即 加入饱 和明 矾 1 mL，立 即 过滤于 盛 有 5 mL 1.5 mol/L 硫 酸溶 液的 三角 瓶中，滤干后 直接 在240 nm 下 比 色测定 吸光 值（As）。并 做无土（A0）和 无基 质（Ak）对 照。B.4.3 结 果计 算 土壤过 氧化 氢酶 活性 以 20 min 内分 解的 过氧 化氢 mg 数表 示为 式B.3：E=AeT/W，Ae=A0-As+Ak，T=CV 867/（A0V0）式中：E 过氧化 氢酶 活性 W 土壤重 T 单位吸 光度 相当 于过 氧化 氢的mg 数 A0 无土对 照溶 液的 吸光 值 Ak 无基质 溶液 的吸 光度 As 样品溶 液的 吸光 度 C 高锰酸 钾溶 液的 浓度（B.2）（B.3）DB23/T 32372022 9 V 吸取V0 mL 的 无 土 对 照 溶 液 用 高 锰 酸 钾 滴 定 所 消 耗 的 高锰酸钾 溶液 的体 积
