1、I C S 6 5.0 8 0C C S B 1 0DB23黑 龙 江 省 地 方 标 准D B 2 3/T 3 1 8 7 2 0 2 2花 卉 肥 用 原 料 纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 粉 制 备 技 术规 程2 0 2 2-0 5-0 9 发 布 2 0 2 2-0 6-0 8 实 施黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 2 3/T 3 1 8 7 2 0 2 2I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规定 起 草。请 注 意 本 文 件 的 某
2、 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 黑 龙 江 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会 提 出。本 文 件 起 草 单 位：哈 尔 滨 瑞 康 源 生 物 科 技 有 限 公 司、黑 龙 江 省 绿 色 食 品 科 学 研 究 院。本 文 件 主 要 起 草 人：王 英 男、杨 冬、刘 丹 怡、王 英 鹏、吴 春 梅、刘 丽、王 克 红。D B 2 3/T 3 1 8 7 2 0 2 21花 卉 肥 用 原 料 纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 粉 制 备 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 花
3、 卉 肥 用 原 料 纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 粉 制 备 的 术 语 和 定 义、基 本 要 求、原 料 和 设 备、制 备 流程 与 方 法、保 存 方 法 和 技 术 档 案。本 文 件 适 用 于 花 卉 肥 用 原 料 纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 粉 制 备。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的
4、 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B 2 0 2 8 7 农 用 微 生 物 菌 剂N Y/T 8 8 3 农 用 微 生 物 菌 剂 生 产 技 术 规 程N Y/T 1 1 1 4 微 生 物 肥 料 实 验 用 培 养 基 技 术 条 件3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1纳 豆 芽 孢 杆 菌纳 豆 芽 孢 杆 菌(B a c i l l u s s u b t i l i s n a t t o)是 食 品 纳 豆 中 分 离 出 来 的 菌 种，是 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 一 个亚 种，属 于 一 类 革 兰 氏 阳 性、好 氧
5、 型、内 生 抗 逆 芽 孢 的 杆 状 细 菌。3.2纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 粉纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 粉 指 纳 豆 芽 孢 杆 菌 经 发 酵 培 养 后 再 加 工 制 成 的 含 有 纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 体 和 纳 豆 芽 孢杆 菌 发 酵 产 物 的 粉 末 状 固 形 物。4 基 本 要 求菌 种、培 养 基、发 酵 环 境、条 件 等 应 符 合 N Y/T 8 8 3 的 规 定。5 原 料 和 设 备5.1 原 料5.1.1 菌 种纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 种 来 源 应 符 合 G B 2 0 2 8 7 的 规 定。D B 2 3/T 3 1 8 7
6、2 0 2 225.1.2 培 养 基 原 料牛 肉 膏、蛋 白 胨、酵 母 膏、葡 萄 糖、N a C l、糖 蜜、纳 豆 粉、破 壁 酵 母、磷 酸 氢 二 钠、磷 酸 二 氢 钠、水、琼 脂。5.1.3 辅 助 原 料二 氧 化 硅、保 护 剂、赋 形 剂。5.2 仪 器 与 设 备超 净 工 作 台、电 热 恒 温 培 养 箱、恒 温 震 荡 器、分 析 天 平、p H 测 定 仪、喷 雾 干 燥 机。6 制 备 流 程 与 方 法6.1 制 备 流 程菌 种 培 养 种 子 液 制 备 放 大 发 酵 发 酵 培 养 放 大 发 酵 收 集 菌 泥 发 酵 液 的 浓 缩 干 燥。6
7、.2 制 备 方 法6.2.1 菌 种 培 养6.2.1.1 培 养 基 制 备菌 种 培 养 培 养 基：牛 肉 膏 5 g/L，蛋 白 胨 1 0 g/L,N a C l 5 g/L,酵 母 膏 5 g/L，葡 萄 糖 5 g/L，琼 脂 粉1 8 g/L，p H 7.0，培 养 基 制 备 方 法 按 照 N Y/T 1 1 1 4 的 规 定 执 行。6.2.1.2 菌 种 培 养 方 法菌 种 培 养 方 法 应 符 合 下 列 规 则。a)冷 冻 干 燥 管 的 纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 种 应 在 无 菌 环 境 下 操 作：1)冷 冻 干 燥 管 表 面 用 7 0%酒 精
8、擦 拭 后，在 火 焰 上 加 热 外 管 尖 端，滴 数 滴 无 菌 水 于 加 热 处，使外 管 破 裂，再 以 硬 棒 等 敲 破 尖 端；2)取 出 隔 热 纤 维 纸 和 内 管，以 无 菌 镊 子 取 出 内 管 之 棉 塞，用 无 菌 吸 管 吸 取 无 菌 液 体 培 养 基0.3 m L 0.5 m L 滴 入 管 内 并 轻 微 震 荡（可 用 该 吸 管 协 助），直 至 菌 体 冻 干 粉 混 匀 悬 浮。b)-2 0 C-8 0 C 低 温 保 存 的 甘 油 管 应 进 行 如 下 操 作：1)从 低 温 保 存 条 件 取 出 的 纳 豆 芽 孢 杆 菌 甘 油
9、管 置 于 3 7 C 水 浴 槽 中 的 管 架 上，不 断 轻 微 摇 动（液 面 不 可 高 至 管 塞），直 至 结 冰 完 全 溶 解；2)上 述 完 全 混 匀 后 的 菌 悬 液 接 种 于 上 述 固 体 斜 面 培 养 基 上，于 3 7 C 恒 温 静 置 培 养 2 4 h。c)4 C 保 存 的 纳 豆 芽 孢 杆 菌 菌 体 或 者 菌 液 可 直 接 转 接 培 养。6.2.2 种 子 液 制 备6.2.2.1 种 子 培 养 基 制 备种 子 培 养 基：牛 肉 膏 5 g/L，蛋 白 胨 1 0 g/L,葡 萄 糖 1 0 g/L，酵 母 膏 5 g/L，N a
10、 C l 5 g/L,p H 7.0。6.2.2.2 种 子 培 养活 化 后 的 菌 体 接 种 于 种 子 培 养 基 中，3 7 恒 温 震 荡（2 0 0 r/m i n）培 养 2 4 h，得 到 种 子 液。D B 2 3/T 3 1 8 7 2 0 2 236.2.3 放 大 发 酵6.2.3.1 发 酵 培 养 基 制 备发 酵 培 养 基：糖 蜜 3 g/L 5 g/L，纳 豆 粉 2 5 g/L 3 5 g/L，破 壁 酵 母 2 g/L 4 g/L，磷 酸 氢 二 钠 1 g/L 1.5 g/L，磷 酸 二 氢 钠 1 g/L 1.5 g/L，p H 调 至 7.0 7.
11、5，琼 脂 2 0 g/L 3 2 g/L。6.2.3.2 发 酵 培 养得 到 的 液 体 种 子 均 匀 喷 在 发 酵 固 体 平 板 培 养 基 表 面，然 后 放 置 于 恒 温 发 酵 室 内 3 7,2 4 h,封 闭 发酵 培 养。6.2.4 收 集 菌 泥固 体 平 板 培 养 基 取 出 发 酵 室，然 后 用 灭 菌 后 的 薄 片，将 所 述 固 体 平 板 培 养 基 上 的 菌 泥 刮 下 来，收 集，得 到 菌 泥。6.2.5 发 酵 液 的 浓 缩 干 燥将 所 述 菌 泥 与 水 按 质 量 比 1:0.5 3 混 合，得 到 菌 液，再 将 所 述 菌 液
12、按 质 量 比 菌 液：二 氧 化 硅 1:1 1 5 添 加 二 氧 化 硅，进 行 吸 附 干 燥，过 筛，将 筛 上 物 进 行 粉 碎 后 再 次 过 筛，得 到 菌 粉；或 将 所 述 菌 泥 与 保护 剂 按 照 质 量 比 1:0.5 2 混 合 后，形 成 混 合 液，按 所 述 混 合 液 质 量 的 9 1 1 添 加 赋 形 剂，再 利 用 喷雾 干 燥 剂 对 混 合 液 进 行 喷 雾 干 燥，喷 雾 干 燥 进 口 温 度 为 1 2 0，出 口 温 度 为 6 0 7 0，收 集 固 形 物，得 到 菌 粉。7 保 存 方 法放 于 阴 凉 干 燥 处 保 存 为 宜。8 技 术 档 案应 建 立 制 备 技 术 档 案，内 容 包 括：原 料 档 案、制 备 方 法 档 案、保 存 方 法 档 案 等。
