1、I C S 6 5.1 0 0.0 1C C S G 2 4DB23黑 龙 江 省 地 方 标 准D B 2 3/T 3 1 8 8 2 0 2 2花 卉 用 戊 糖 乳 杆 菌 细 菌 素 制 备 技 术 规 程2 0 2 2-0 5-0 9 发 布 2 0 2 2-0 6-0 8 实 施黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 2 3/T 3 1 8 8 2 0 2 2I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规定 起 草。请 注 意 本 文 件 的 某
2、些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 黑 龙 江 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会 提 出。本 文 件 起 草 单 位：哈 尔 滨 瑞 康 源 生 物 科 技 有 限 公 司、黑 龙 江 省 绿 色 食 品 科 学 研 究 院。本 文 件 主 要 起 草 人：王 英 男、黄 艳 玲、刘 容 旭、吴 春 梅、王 英 鹏、刘 丽、王 克 红。D B 2 3/T 3 1 8 8 2 0 2 21花 卉 用 戊 糖 乳 杆 菌 细 菌 素 制 备 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 花 卉 用
3、戊 糖 乳 杆 菌 细 菌 素 制 备 的 术 语 和 定 义、材 料 和 设 备、技 术 要 求、保 存 方 法 和 技术 档 案。本 文 件 适 用 于 花 卉 用 戊 糖 乳 杆 菌 细 菌 素 的 制 备。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B 4 7 8 9
4、.3 5 2 0 1 6 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 乳 酸 菌 检 验N Y/T 1 1 1 4 2 0 0 6 微 生 物 肥 料 实 验 用 培 养 基 技 术 条 件3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1戊 糖 乳 杆 菌 L S 1戊 糖 乳 杆 菌 L S 1 是 从 发 酵 蔬 菜 中 分 离 出 来 的 一 种 乳 酸 菌 类 微 生 物。4 材 料 和 设 备4.1 材 料4.1.1 菌 种细 菌 素 生 产 菌 株：戊 糖 乳 杆 菌 L S 1 菌 株；指 示 菌 株：单 核 细 胞 性 李 斯
5、 特 菌（L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s）C M C C 5 4 0 0 4 和 大 肠 杆 菌（E s c h e r i c h i a c o l i）A T C C 2 5 9 2 2 菌 株。4.1.2 培 养 基选 择 M R S(M a n R o g o s a S h a r p e)培 养 基 为 菌 株 活 化、计 数 和 发 酵 用 培 养 基。M R S 培 养 基 配 方 按 照 G B4 7 8 9.3 5 2 0 1 6 中 附 录 A 的 规 定 执 行，培 养 基 的 配 制 方 法 按 照 N Y/T 1
6、 1 1 4 2 0 0 6 中 第 4 章 的 规 定 执 行。4.1.3 试 剂 与 耗 材硫 酸 铵、2 0 m m o l/L 醋 酸 盐 缓 冲 液（p H 3.8）、牛 津 杯、0.2 2 m 孔 径 的 硝 酸 纤 维 素 膜、S e p h a d e x G-1 0色 谱 柱。4.2 设 备D B 2 3/T 3 1 8 8 2 0 2 22超 净 工 作 台、细 菌 厌 氧 培 养 箱、p H 计、真 空 冷 冻 干 燥 机、7 5 2 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 和 高 效 液 相 色 谱仪。5 技 术 要 求5.1 菌 株 培 养将 活 化 后 的 戊 糖 乳
7、杆 菌 L S 1 接 种 到 M R S 液 体 培 养 基 中，并 培 养 至 对 数 生 长 期（有 效 活 菌 数 达 1 08C F U/m L，计 数 方 法 按 照 N Y/T 1 1 1 4 2 0 0 6 中 第 6 章 的 规 定 执 行）作 为 培 养 物。将 5%的 戊 糖 乳 杆 菌 L S 1（1 8 h菌 龄）培 养 物 接 种 到 M R S 液 体 培 养 基 上，3 7 厌 氧 培 养 4 2 h，8 0 0 0 r/m i n 离 心 1 5 m i n 后，通 过 0.2 2 m膜 过 滤 得 到 上 清 液 与 菌 体，取 上 清 液 用 3.0 m
8、o l/L N a O H 溶 液 将 p H 值 调 至 6.5，冻 干 备 用。5.2 细 菌 素 分 离取 1 5 g 冻 干 样 品 溶 于 1 0 0 0 m L 去 离 子 水，用 6 0%饱 和 度 的 硫 酸 铵，在 转 速 1 2 0 r/m i n 条 件 下 搅 拌2 4 h，然 后 1 0 0 0 0 r/m i n、4 离 心 2 0 m i n，通 过 0.2 2 m 孔 径 的 硝 酸 纤 维 素 膜 过 滤 分 别 得 到 上 清 液与 沉 淀。以 单 核 细 胞 性 李 斯 特 菌 C M C C 5 4 0 0 4 和 大 肠 杆 菌 A T C C 2 5
9、 9 2 2 为 指 示 菌，采 用 琼 脂 扩 散 牛 津 杯 法分 别 测 定 沉 淀 复 溶 液 与 上 清 液 的 抑 菌 圈 直 径，并 以 没 有 接 菌 的 培 养 基 经 硫 酸 铵 沉 淀 后 的 沉 淀 复 溶 液 作 空白 对 照。5.3 细 菌 素 纯 化5.3.1 初 度 纯 化离 心 过 滤 后 的 上 清 液 通 过 S e p h a d e x G-1 0 柱 液 相 色 谱 系 统 脱 盐 并 纯 化，以 超 纯 水 为 缓 冲 液，流 速 为 6m L/m i n，然 后 在 2 8 0 n m 紫 外 波 长 检 测 细 菌 素，采 用 琼 脂 扩 散
10、牛 津 杯 法 测 定 其 抑 菌 活 性。5.3.2 中 度 纯 化将 S e p h a d e x G-1 0 柱 液 相 色 谱 系 统 脱 盐 并 纯 化 得 到 的 细 菌 素 粗 品 在 p H 3.8 的 2 0 m m o l/L 醋 酸 盐 缓冲 液 条 件 下 进 行 S P S e p h e r o s e F a s t F l o w 纯 化，用 N a C l 溶 液 梯 度（0 m o l/L 0.5 m o l/L）线 性 洗 脱 细菌 素，流 速 为 5.0 m L/m i n。然 后 在 2 8 0 n m 紫 外 波 长 紫 外 检 测 细 菌 素，并
11、 测 定 其 抑 菌 活 性。然 后 合 并 活性 流 份，用 S e p h a d e x G-1 0 柱 液 相 色 谱 系 统 脱 盐 后，真 空 冷 冻 干 燥。5.3.3 精 细 纯 化采 用 S u p e r d e x 3 0 I n c r e a s e 作 为 最 后 一 步 纯 化 介 质，通 过 S e p h a d e x G-1 0 柱 液 相 色 谱 系 统 脱 盐 并纯 化，用 5 m L 醋 酸 盐 缓 冲 液 溶 解 冻 干 样 品，使 用 S u p e r d e x 3 0 I n c r e a s e，平 衡 2 次 柱 体 积，在 p H
12、5.2条 件 下 洗 脱，洗 脱 的 摩 尔 浓 度 乘 以 体 积 为 1.5 V，在 2 8 0 n m 紫 外 波 长 处 检 测 细 菌 素，流 速 1.0 m L/m i n，每 6 m L 为 一 管 进 行 收 集，通 过 琼 脂 扩 散 牛 津 杯 法 测 定 其 抑 菌 活 性。6 保 存 方 法使 用 冻 干 机 将 细 菌 素 制 成 冻 干 制 品，于 4 8 以 下 保 存。7 技 术 档 案D B 2 3/T 3 1 8 8 2 0 2 23应 建 立 技 术 档 案，内 容 包 括：菌 种、培 养 基、试 剂 及 耗 材、设 备、菌 种 培 养、细 菌 素 分 离、细 菌 素纯 化 等。D B 2 3/T 3 1 8 8 2 0 2 24参 考 文 献 1 李 志 如 等.戊 糖 乳 杆 菌 L S 1 细 菌 素 的 分 离 纯 化 及 性 质 鉴 定.J.食 品 科 学,2 0 2 0.
