1、 ICS 65.020.01 CCS B25 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 2690 2022 青贮饲料 中 乳酸菌 菌种的分 离与保藏 技术规程 Technical protocol for isolation and preservation of lactic acid bacteria strains in silage 2022-07-15 发布 2022-08-15 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 2690 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则
2、 的 规 定起草。本文件 由内 蒙古 农业 大学 提出。本文件 由内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 19）归口。本文件 起草 单位：内 蒙古 农业大 学、内蒙 古自 治区 农牧业 科学 院、中国 农业 科学院 草原 研究 所、白城师范 学院、巴 林左 旗林 业和草 原局、内 蒙古 伊禾 绿锦农 业发 展有 限公 司。本文件 主要 起草 人：格根 图、包 健、贾玉 山、王志 军、孙 林、尤思 涵、都帅、降晓 伟、侯美 玲、丁霞、卢 强、马千 鹏、王瑞 峰、赵 牧其 尔、李宇 宇、刘明健、王 宇、张佳 伟。DB15/T 2690 2022 1 青贮饲料 中乳酸 菌菌
3、种的 分离与 保藏技术 规程 1 范围 本文件 规定 了青 贮饲 料中 乳酸菌 菌种 分离 与保 藏的 基本原 则、设备、试 剂、菌 种分离、菌 种保 藏 方法。本文件 适用 于青 贮饲 料中 乳酸菌 菌种 的分 离与 保藏。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 4789.28 食品 安全 国家标 准 食品 微生 物学 检 验 培 养基 和试 剂的
4、质量 要 求 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 20287 农用 微生 物菌 剂 SN/T 1538.1 培养 基制 备 指南 第1 部分：实 验室 培 养基制 备质 量保 证通 则 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和定 义。4 基本原 则 应针对 菌种 的生 物学 性状 选择分 离与 保藏 方法。应使分 离和 保藏 的菌 种不 染杂菌，使 退化 和死 亡降 到最低 限度。应保证 菌种 分离 和保 藏的 安全性，不 能对 周围 环境 造成污 染和 危害。5 设备 恒温培 养箱：5 60。厌氧培 养装 置：5 60。振荡器：往 复式。冰箱：
5、4 冰箱、超 低温 冰箱（-50-86）。分析天 平：感 量 0.001 g。光学显 微镜：4 100。均质器 及无 菌均 质袋、均 质杯或 灭菌 乳钵。水浴锅：0 100。超净工 作台。DB15/T 2690 2022 2 6 试剂 乳酸菌 培养 基：MRS 琼脂，见附 录A。稀释液：称 取氯 化 钠 8.5 g，溶 于1000 mL 蒸 馏水 中，分装 后，121 高 压灭 菌30 min。所用试 剂均 为分 析纯，水 符合 GB/T 6682 三级 水规 格。7 乳酸菌 菌种 分离 菌液制 备 以无菌 操作 称取10 g 样 品 置于盛 有90 mL 无菌 生理 盐 水的聚 乙烯 均质
6、袋内，用 拍打式 无菌 均质 器拍打2 min，制成1：10 的样 品菌液。菌液稀 释 用1 mL 无 菌吸 管（移 液枪）吸 取1:10 样 品匀 液1 mL，沿 管壁 缓慢 注于 装有9 mL 无菌 水的 无菌 试管中，振 摇试 管或 利用 小型 试管振 荡器 使其 混合 均匀，按1 10 进行系 列稀 释，分别得 到1 1101、11102、11 103、1 1 104，1 1 105 稀释 的样 品菌液（每 个稀 释度 应更 换移液 管或 枪头）。菌种培 养 按照GB 20287 规 定制 备琼 脂培养 基，于 高压 灭菌 锅 灭菌后 备用。选择23 个 适宜稀 释度 的样 品菌 液（
7、可包 括原 液），吸 取20 L样品 菌液 于制 备好 的无 菌 琼脂培 养基 培养 皿内，利 用 无菌涂 布棒 涂抹 均匀，每个稀 释度 做两 个培 养皿。同 时，分 别吸 取20 L 空 白稀释 液加 入两 个无 菌培 养皿内 作空 白对 照。将 培养皿翻 转，倒置 于恒 温培 养箱（乳酸 菌：30 厌 氧 条件下 培养72 h）。乳酸菌 的分 离与 纯化 观察菌 落的 形态、大 小、颜色和 光泽，选 择典 型的 菌落进 行革 兰氏 染色、镜 检和过 氧化 氢试 验。经过革兰 氏染 色（呈阳 性）和 过氧化 氢（呈阴 性）试验，初步判 断乳 酸菌 种类。用 接种环 挑取 典型 菌落12于M
8、RS 琼脂 斜面 培养 基上，用接 种环 从底 部自 下而 上划密“之”字 形线，在30 恒温 厌氧 培养 箱中 培养48 h 72 h，重复 划线 分离培 养3 次，得到 纯化 的 单菌株。乳 酸菌 菌种 分离 及筛选 程序 见图1。乳酸菌 的筛 选 7.5.1 生长繁 殖能 力 将分离 纯化 的乳 酸 菌 菌液 混匀并 提取 其悬 液以6%的 浓度接 种至 MRS 培养 基中，恒温 培养（37）24 h，期 间每2 h 用 紫外 可 见分光 光度 计测 其在 波长620 nm 的OD 值，每 个菌 种均 重复3 次，最 终将 测定 结果绘制 生长 曲线。7.5.2 产酸能 力 将乳酸 菌菌
9、 液混 匀，提取 其悬液 以3.0%的 浓度 接种 于pH=6.5 的MRS 液体 培养 基 中，恒 温（37）培养24 h，期间 每2 h 用pH 计 测发酵 液的pH值，每 个菌 种均重 复3 次，最终 将测 定 结果绘 制产 酸速 率曲 线。7.5.3 生理生 化特 性 将乳酸 菌菌 株以3%的 浓度 接种于 MRS 液 体培 养基，分别在4，10，30，45 条件 下进 行培养，其中4 培养10 d，10 与30 培养3 d，45 培养7 d，培养 结束 后观察 乳酸 菌菌 株对 温 度DB15/T 2690 2022 3 的响应 情况。分 别在pH 值为3.0，3.5，4.0，5.0
10、，6.0，7.0，8.0，9.0 以及 浓度为3.0%和6.5%NaCl 的 MRS液 体培 养基 中30 培 养48 h，观察 乳酸 菌菌 株 对酸碱 与盐 的耐 受能 力。采用紫 外可 见分 光光 度计 测定乳酸 菌在 波长620 nm 的OD 值，以判 断乳 酸菌 在不 同 环境下 的生 长情 况（弱生 长：0.2 小于OD 值 小于0.5，生长：0.5 小于OD 值 小于0.1，不 生长：OD 值小 于0.2，生 长好：OD 值大 于1.0）。用 细菌 微量 生化 鉴定管检 测乳 酸菌 菌株 对49 种碳源 的利 用情 况，均重 复测定3次。图1 菌种分 离及 筛选 程序 8 菌种保
11、藏方 法 定期移 植保 藏法 按附录B的 规定。低温冷 冻保 藏法 按附录C的 规定。DB15/T 2690 2022 4 A A 附录A（规范 性）乳酸菌 培养 基 A.1 MRS 培 养基 乳酸菌 培养 基见 表A.1。表A.1 乳酸 菌培 养基 成分组成 称取量 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温 80 1.0 mL K2HPO4 7H2O 2.0 g 醋酸钠3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO4 7H2O 0.2 g MnSO4 4H2O 0.05 g A.2 制法 将上述 成分 加入 到1000 mL 蒸馏水 中
12、，加 热溶 解，调节pH 至6.2 0.2，分装 后121 高压 灭菌15 min。DB15/T 2690 2022 5 B B 附录B（规范 性）定期移 植保 藏法 B.1 适用范 围 本方法 广泛 适用 于细 菌、放线菌、真 菌等 的短 期保 藏。B.2 原料 保藏培 养基 一般 含有 机氮 多，糖分 总量 不超 过2%，既 能满足 菌种 培养 时生 长繁 殖的需 要，又 可防 止因产酸 过多 而影 响菌 种性 能。大多 数在 低温 条件 下 保藏可 大大 减缓 菌种 的代 谢活动，抑制 繁殖 速度，降低突变 频率，延 长菌 种保 藏时间。B.3 技术要 求 B.3.1 不同菌 种应 根据
13、 要求 选择 合适的 培养 基。B.3.2 接种时 要求 无菌 操作，避 免污染。B.3.3 保藏期 间要定 期检 查菌种 存放的 房间、冰箱、冷库 等的温 度、湿 度，不可使 培养基 干枯，如 发现异常 应重 新移 植培 养。B.3.4 在传代 过程中，将 保藏菌 种在营 养贫乏 和丰 富的新 鲜培养 基中作 交替 培养，有利于 保持菌 种 的优良特 性。B.3.5 每次移 植培养 后，应于原 保藏菌 株及其 登记 卡片（包含菌 株名称、编 号、所 用培养 基等信 息）逐个对 照，检查 无误 后再 存放。B.3.6 保藏菌 种的 移植 不宜 频繁，每次 移植 时，数量 可以 多一些，以 延长
14、 使用 期。B.4 方法与 步骤 B.4.1 培养基 制备 按 照GB/T 4789.28 和SN/T 1538.1 执行。B.4.2 接种 B.4.2.1 斜面接 种 B.4.2.1.1 点接 用接种 环把 菌种 点接 在斜 面中部 偏下 方处。适用 于扩 散型生 长及 绒毛 状气 生菌 丝类霉 菌（如：毛霉、根霉等）。B.4.2.1.2 中央划 线 用接种 环从 斜面 中部 自下 而上划 一直 线。适用 于细 菌和酵 母菌 等。B.4.2.1.3 稀波状 蜿蜒 划线 法 DB15/T 2690 2022 6 用接种 环从 斜面 底部 自下 而上划 稀“之”字 形线。适 用于易 扩散 的细
15、菌，也适 用于部 分真 菌。B.4.2.1.4 密波状 蜿蜒 划线 法 用接种 环从 斜面 底部 自下 而上划 密“之”字 形线。能 充分利 用斜 面获 得大 量菌 体细胞，适用 于细 菌 和酵母菌 等。B.4.2.1.5 挖块接 种法 用接种 铲挖 取菌 丝体 连同 少量琼 脂培 养基，转 接到 新鲜斜 面上。适 用灵 芝等 担子菌 类真 菌。B.4.2.2 穿刺接 种 用接种 针从 原菌 种斜 面上 挑取少 量菌 苔，从 平固 体 培养基 中心 自上 而下 刺入，直 到接 近管 底（勿 穿到管底），然后 沿原 穿刺 途径慢 慢伸 出接 种针。适 用于细 菌和 酵母 菌等。B.4.2.3 液
16、体菌 种 挑取少 量固 体斜 面菌 种或 用无菌 滴管 等吸 取原 菌液 接种于 新鲜 液体 培养 基中。B.4.3 培养 将接种 后的 培养 基放 入30 38 的恒 温培 养箱 中，培养 至良 好状 态，根据 菌 种类别 确定 设定 温度。B.4.4 保藏 B.4.4.1 保藏温 度 培养好 的菌 种于4 6 保藏，有 些菌 种（如：部分弧 菌、假单 胞菌 等）4 6 容易 死亡，适于25 室温 保藏。B.4.4.2 保藏湿 度 通常相 对湿 度为50%70%。B.4.5 定期移 植 定期移 植的 间隔 时间，因 微生物 种类 不同 而异。一 般不产 生芽 孢的 细菌 间隔 较短，需1 2
17、周，最 长一个月 移植 一次。放 线菌、酵母 菌和 丝状 真菌 间隔 时间较 长，每4 6个 月移 植一次 即可。对 于某 些 菌 种（如：芽裂 酵母，棉 病囊 霉等），应13 个月 移植 一次。按相 应的 间隔 时间 将保藏 菌种 转接 到新 鲜 培 养基中，在30 38 培 养，根 据菌 种类 别确 定设 定温度。DB15/T 2690 2022 7 C C 附录C（规范 性）低温冷 冻保 藏法 C.1 适用范 围 本方法 适用 于大 多数 需要 长期保 藏的 细菌、真 菌、放线菌、病 毒等。C.2 原理 大多数 微生 物可 在-60 及以下 的低 温中 保藏。通 过低温，使 微生 物代
18、谢活 动停止。一 般而 言，冷冻温度 愈低，效 果愈 好。C.3 技术要 求 C.3.1 为了获 得满 意的 冷冻 效果，应在 培养 物中 加入 一定 的冷冻 保护 剂。C.3.2 冷冻保 藏时，要 掌握 好冷 冻速度 和解 冻速 度。C.3.3 注意低 温冰箱 的故 障和停 电事故，可以 在低 温槽内 留有一 定的空 间，如果发 生使低 温冰箱 温 度变化的 情况，可 加入 干冰 以防止 培养 融化。C.3.4 融化后 的菌 种不 能再 用低 温保藏，应 重新 接种 后再 冷冻保 藏。C.4 方法与 步骤 C.4.1 冻存管 的准 备 将2.0 mL 冻存 管（圆底 硼 硅玻璃 安瓶 管或
19、螺旋 式塑 料管）清洗 干净，121 高压灭 菌15 min 20 min，备用。也 可使 用商 品 化的菌 种保 藏管。注 意冻 存管不 能有 裂纹。C.4.2 保护剂 的准 备 保护剂 种类 要根 据微 生物 的类别 选择，一 般采 用无 菌 的10%20%甘油 或脱 脂奶 粉，或10%二甲 亚砜。C.4.3 培养物 的准 备 微生物 不同 的 生 理状 态对 存活率 有影 响，一般 使用 对数生 长中 后期 培养 物。菌种的 准备 可采 用下 列几种方 法：a)刮取培 养物 斜面 上的 孢子 或菌体，与 保护 剂混 匀后 加入冻 存管 内；b)接种液 体培 养基，振 荡培 养后取 菌悬
20、液与 等体 积的 保护剂 混匀 后分 装于 冻存 管内；c)将培养 物在 平皿 培养，形 成菌落 后，用无 菌打 孔器 从平板 上切 取一 些大 小均 匀的小 块（直径 约5 mm10 mm），真 菌最 好 取菌落 边缘 的菌 块，与保 护剂混 匀后 加入 冻存 管内；d)在安瓶 管 中 1.2 mm 2 mm 的琼脂 培养 基，接种 菌种，培 养 2 d10 d 后，加 入保护 剂，待 保藏。C.4.4 冷冻保 藏 将含菌 种的 冻存 管插 入保 藏塑料 盒中 置于-60 80 低温 冰箱 中保 藏，保 藏期间 应定 期检 查活力及杂 菌情 况。保藏 周期 一般1 5年。DB15/T 2690 2022 8 C.4.5 复苏方 法 从冰箱 中取 出菌 种冻 存管，应立 即置37 40 水浴中 轻轻 摇动，直 到融 化为止。开 启冻 存管，将内容 物移 接至 适宜 的培 养基培 养。
