1、 ICS 65.020.20 CCS B 05 13 河北省地方标准 DB 13/T 5583 2022 噬菌体防 控奶牛乳 房炎技术 规程 2022-05-31 发布 2022-07-01 实施 河北省市 场监督 管 理局 发 布 DB 13/T 5583 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标 准化 文件 的结 构 和起草 规则 的规定起草。本文件 由河 北省 农业 农村 厅提出。本文件 起草 单位：河 北工 程大学、中 国农 业大 学、河北乐 源牧 业有 限公 司。本文件 主要 起草 人：石玉 祥、韩 博、高健、钟翠 红、侯新峰
2、、王 皓婷、朱 阵、支龙彬、刘 江涛、靳爱红、张 晓云、郜 霞、崔玉革、张 欢。DB 13/T 5583 2022 1 噬 菌体防 控奶牛乳 房炎技 术规程 1 范围 本文件规定了 噬菌体防控 奶牛乳房炎的 病原菌分离 鉴定、噬菌体悬浮液的制 备、防控措施等技术要求。本文件适用于由无乳链球 菌、金黄色葡萄球菌、大 肠杆菌和肺炎克雷伯杆菌 等细菌性奶牛乳房炎的噬 菌体 预防 和治 疗。2 规范性 引用 文件 下列文件中的内容通过文 中的规范性引用而构成本 文件必不可少的条款。其 中，注日期的引用文件，仅该 日期 对应 的版 本适用 于本 文件；不 注日 期的引 用文 件，其最 新版 本（包 括所
3、 有的 修改 单）适用于 本文 件。GB/T 14926.13 实 验动 物 肺炎 克雷 伯杆 菌检 测方 法 GB/T 16586 奶 牛场 卫生 规范 NY/T 541 动物 疫病 实验 室检验 采样 方法 NY/T 555 动物 产品 中大 肠菌群、粪 大肠 菌群 和大 肠杆菌 的检 测方 法 NY/T 1948 兽 医实 验室 生 物安全 要求 通则 NY/T 2962 奶 牛乳 房炎 乳 汁中金 黄色 葡萄 球菌、凝 固酶阴 性葡 萄球 菌、无乳 链球菌 分离 鉴定 方法 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的 术 语和定 义。4 病原菌 的分 离鉴 定 参照NY/T 541
4、 采 集样 品后，按照NY/T 2962 分离 鉴定 金黄色 葡萄 球菌、凝 固酶 阴性葡 萄球 菌、无乳链球 菌；按照GB/T 14926.13 分 离鉴 定肺 炎克 雷伯 杆菌；按照NY/T 555 分 离 鉴定大 肠杆 菌；按传 统方法分 离鉴 定其 它乳 房炎 源性病 原菌。5 噬菌体 混悬 液的 制备 污水采 集与 处理。从奶 牛 养殖场 污水 管道 采集 污水 样品，8000 r/min 离心15 min，取上 清液，弃沉淀，经0.22 m 微 孔 滤器过 滤，滤液 备用。噬菌体 的分 离纯 化。将鉴 定的病 原菌 作为 诱导 菌，利用双 层琼 脂平 板法 培养 噬菌体，挑 选大
5、小一致噬菌斑，再利用双层 琼脂平板法纯化培养噬菌 体。吸取噬菌体纯化液，加至电镜专用铜网上，用2%醋酸 铀染 色，干 燥，通过透 射电 子显 微镜 观察 噬菌体 超微 结构。再 利用 双层琼 脂平 板法 对具 有典型形 态特 征的 噬菌 体进 行纯化。宽谱噬 菌体 的筛 选。将鉴 定的病 原菌 菌液 接种 于双 层平板，静 置，再取 噬菌 体悬液 滴于 双层 琼脂平板 上，倒置 于37 恒 温箱中，过 夜培 养，观 察 双层琼 脂平 板是 否形 成噬 菌斑，根据 噬菌 体吞 噬不同种 类病 原菌 菌株 的数 量筛选 宽谱 噬菌 体。噬菌体 混悬 液的 制备。将 0.5 mL 病 原菌 噬菌 体
6、混 悬 液加 到 3 mL LB 液 体培 养 基后，分别 加入100 L 同 种病 原菌 菌液，37 220 r/min 条 件下，置于摇 床震 荡培 养 16 h。4 条件 下8000 r/min离心10 min，将 沉淀再 用无 菌水悬 浮；再用0.22 m 滤膜过 滤悬 液。滤液（噬 菌 体浓度 1104 PFU/mL）4 保 存。噬菌体 混悬 液污 染状 况检 测。取噬 菌体 混悬 液，均匀 涂布于 普通 营养 琼脂 平板 培养基，37 倒置培 养24 h，观 察培 养平 板有无 菌落 生长。若 有细 菌菌落 生长，应 重新 过滤 或制备 噬菌 体混 悬液。DB 13/T 5583
7、2022 2 6 防控 6.1.1 环境病 原菌 的净 化。牛舍、运动场 空间 宽敞，保 持阳 光充足；保 持牛 床清 洁、干 燥，垫料干、软、清 洁、新鲜，奶 牛场 卫 生符 合GB/T 16586 规定；根据 奶牛 乳房 炎源 性病 原菌的 分离 鉴定 种类 制备噬菌 体混 悬液，按1%比 例向新 制备 病原 菌噬 菌体 混悬液 加水，混 匀，用 稀释 液喷洒 奶牛 舍的 卧床、运动场 及料 槽，每 周1 次。6.1.2 奶牛乳 头病 原菌 的净 化。挤奶完 毕，用温 水清 洗奶 牛的乳 房后，将 其乳 头完 全浸于 盛 有 60%碘液药 浴杯 中5 10 秒；乳 头药浴 风干，再将 乳头
8、 浸于 盛有新 制备 噬菌 体混 悬液 药浴杯 中 5 10 秒。6.1.3 饲养管 理。根据营 养需 要配 制奶牛 各生 产阶 段精、粗饲 料，增 加奶 牛青绿、青 贮料 的饲喂 量。干奶后 期，增 加奶 牛精 料、维 生素 E、硒的饲 喂量，控制盐 和多 汁饲 料的 饲喂 量。减少 环境 冷、热及挤奶应 激，增加 奶牛 的运 动量。7 治疗 消除病 原。参照 6.1.2 用 碘液对 奶牛 乳头 消毒；再 用噬菌 体混 悬液 浸浴。严 重病例，可 同时 配合药物 治疗。辅助治 疗。加 强饲 养管 理，做 好乳 房卫 生，提 高奶 牛抗病 力；同 时参 照 6.1.1 用消 毒液、噬菌体混悬 液喷 洒奶 牛舍 和运 动场。8 生物安 全 实验室 操作 参照NY/T 1948 兽医实 验室 生物 安全 要求 通则。
