1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 13 河北省地方标准 DB 13/T 5573 2022 鸡粪肠球 菌病综合 诊断技术 规程 2022-05-31 发布 2022-07-01 实施 河北省市 场监督 管 理局 发 布 DB 13/T 5573 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标 准化 文件 的结 构 和起草 规则 的规定起草。本文件 由河 北省 农业 农村 厅提出。本文件 起草 单位：河 北工 程大学、河 北征 宇制 药有 限公司。本文件 主要 起草 人：柳焕 章、刘 建钗、张 鹤平、刘 利强、刘会 洽、闫金 坤、
2、崔国林、王 宏艳、刘彦威、刘娜、王 春霞、程 龙、刘 学彬、李 晶晶、娄 路平、李夫 宏。DB 13/T 5573 2022 1 鸡 粪肠球 菌病综合 诊断技 术规程 1 范围 本文件 规定 了鸡 粪肠 球菌 病临床 诊断、实 验室 诊断 和综合 判定 等技 术要 求。本文件 适用 于鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌 鹑等 粪肠 球菌 病诊断。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应 用是必不可少的。凡是注 日期的引用文件，仅注日 期的版本适用于本文件。凡是 不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用于 本文件。GB 16548 病 害动 物和 病 害动物 产品 生物
3、安全 处理 规程 3 术语和 定义 下列 术 语和 定义 适用 于 本 文件。粪肠球 菌 Enterococcus faecalis 为革兰 氏阳 性，过氧 化氢 阴性球 菌。4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。BEAA：叠氮 钠-结晶 紫-七 叶苷培 养基；PCR：聚合 酶链 式反 应；H-E染 色：苏木 精-伊 红染 色；TSA：胰蛋 白胨 大豆 琼脂 培 养基；TSB：胰 蛋白 胨 大 豆 液体培 养基；SDS：十二 烷基 磺酸 钠；EDTA：乙二 胺四 乙酸。5 临床诊 断 当禽出 现以 下部 分或 全部 情形时，可 作为 初步 诊断 的依据。临床症 状 各日龄 禽均 可感 染
4、，雏禽 易感，呈眼 神呆 滞、眯 眼、脐炎、呼吸 困难 等症 状；青年禽 呈轻 微腹 泻症状；成年 禽出 现产 蛋量 下降症 状、种蛋 孵化 率明 显降低，死 胚明 显。剖检病 变 死胚皮下有胶冻样物质，肝脏呈土黄色；病雏卵黄 吸收不全，肝脏发生不同 程度坏死、淤血或出血，肺出 血。成年 禽病 变不明 显。6 实验室 诊断 采用荧 光定 量PCR 检 测技 术，结合 临床 症状 确诊。荧光定 量PCR 检测 6.1.1 样品采 集 DB 13/T 5573 2022 2 选择临 床有 症状 的病 禽，采集肝 肺等 病变 组织1 g，放入1.5 mL 灭菌EP 管 中，编号，-20 保存备用。6
5、.1.2 基因 组DNA 提取 取组织 样本0.2 g放 入组 织 研磨器 中研 磨，收集 样本0.05 g 0.1 g于1.5mL EP 管 中，加 入500 L裂解液（400 mM Tris-HCl pH 8.0，60 mM EDTA）pH 8.0，150 mM NaCl，1%SDS），室 温放 置10 min；加150 L 乙酸 钾（pH 4.8），漩 涡震 荡，12000 g离心1 min，取 上清 液放 入新试 管，加入 等体积异丙 醇；DNA 团块 用70%乙醇清 洗，干 燥后 溶解 在50 L TE（10 mM Tris，1 mM EDTA）中 保存。或 者使用DNA 提 取试
6、剂盒 提取。6.1.3 引物合 成 参照GenBank 中 粪肠 球菌sodA 基 因，使用Primer Express 5.0 软 件设 计粪 肠球 菌 特异性 引物（预期扩增 片段 大小360bp）：上游引 物F：5-ACTTATGTGACTAACTTAACC-3 下游引 物R：5-TAATGGTGAATCTTGGTTTGG-3 6.1.4 荧光定 量PCR 反 应体 系和 反应程 序 采用25 L的 反应 体系：SYBR Premix Ex Taq（2）12.5 L，上、下 游引 物各0.5 L，DNA 模板1.0 L，用 双蒸 水补 足至25 L。反应 程序 为：93 预变性5 min
7、；93 15 s，58 15 s，72 30 s，进行40 个循 环，72 延伸7 min，于4 终 止反 应。6.1.5 荧光PCR 结 果判 断 当待测 样品 实时 荧光 定量PCR 检测 结果 有“S”型 扩增曲 线，Ct值36.5，且Tm 值为86 时，判定 待测样品 中含 有鸡 粪肠 球菌，而且 可通 过Ct 值大 小判 断感染 的程 度（参见 附录A）。综合判 定 结合临 床症 状、病理 变化 和荧光 定量PCR 检测 结果，可确诊 鸡粪 肠球 菌病。7 剖检尸 体和 污染 物处 理 病害鸡 只及 其产 品的 生物 安全处 理应 符合GB 16548 的规定。DB 13/T 5573 2022 3 A A 附录A（资料 性）感染程度 推断 A.1 感染程 度推 断 定量PCR标准曲线的建立是 在线性范围内以各浓度（108101）的对数为横坐标，以其对应的Ct值为纵 坐标，用Excel 制作 标准曲 线，得到 回归 方程 y=-2.44 x+30.53，决 定系数 R2=0.9983。因此，可通 过临 床样 品检 测的Ct 值计 算出 其所 含病 原体的 浓度 和数 量，从而 推断感 染的 程度。
