1、 ICS 13.080.99 CCS B 11 13 河北省地方标准 DB 13/T 55722022 堆肥用木 质纤维素 降解菌筛 选技术规 程 2022-05-31 发布 2022-07-01 实施 河北省市 场监督 管 理局 发 布 DB 13/T 55722022 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由河北省农业农村厅提出。本文件起草单位：河北工程大学。本标准主要起草人：柳焕章、刘建钗、陈凯、刘利强、刘会洽、吴志勇、姬国强、王春霞、张良、刘彦威、刘娜、刘孟啸、赵梓筱、董帅、赵海琪、杨硕、赵萍。DB 13/T
2、 55722022 1 堆 肥用木 质纤维素 降解菌 筛选技术 规程 1 范围 本文件规定了堆肥用木质纤维素降解菌菌株筛选的培养基配制、富集培养、菌株分离、初筛、复筛技术等。本文件适用于农林牧及加工业的有机废弃物堆肥、农作物秸秆还田，及其它行业和生活垃圾的有机废物中木质纤维素降解与资源化利用领域。本文件不适用于厌氧发酵和其他材料及形式的处理与利用。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 7959-87 粪便无害化卫生标准 GB 15618-2018
3、土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准 3 术语和 定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 木质纤 维素 由纤维素、半纤维素和木质素组成的复合体，广泛存在于各种植物细胞壁中，是植物有机体和残体的主要构成物质，其结构致密、分解困难，与腐殖质形成有密切关系。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。CMC-Na：羧甲基纤维素钠；CMCase：羧甲基纤维素酶；DNS：3,5-二硝基水杨酸；Lip：木质素过氧化物酶；Mnp：锰过氧化物酶；Lac：漆酶 ABTS：2-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸。5 菌株筛 选 包括样品采集、筛选培养基制备、木质纤维素降解菌的富集与分离、菌株初筛与复筛。筛选培
4、养基 配制 参见附录A。样品采 集 从养殖场、有机肥厂、菌菇厂、垃圾填埋场、污水处理厂、林地和农田等场所采集发酵过程中的粪便、堆肥、菌菇发酵料、活性污泥、腐殖土和耕层土壤等，每种材料采样不少于20 g样品，避光冷藏，在24 h内进行富集或分离培养。富集培 养 DB 13/T 55722022 2 称取各类样品各20 g，充分打散混匀；称取2份10 g混合样品，分别放入2个灭菌的含100 mL木质纤维素富集培养液的250 mL锥形瓶中，两瓶分别于35 和45、160 r/min摇瓶48 h。分离纯 化 取上述富集悬液1.0 mL，依此倍比稀释至105稀释液；均匀涂布于细菌、放线菌、真菌分离培养基
5、平板，2个重复，将稀释平板分别置于35 和45 条件下恒温培养1 d7 d。在培养期间每天观察菌落生长情况，并从适当稀释平板上挑取不同形态单菌落，在新的分离培养基平板上划线分离纯化培养；重复以上操作至得纯菌株。初筛 将分离纯化的菌株分别接种于CMC刚果红培养基、木质素苯胺蓝培养基、木质素亮蓝培养基上。每个平板接种一株菌，35 培养5 d。在明亮背景下观察、测量不同培养基上各菌落直径（d）及其周围透明圈的直径（D），并计算同一菌株透明圈直径与菌落直径比值（D/d）。在CMC刚果红培养基上D/d4，或在木质素苯胺蓝培养基或木质素亮蓝培养基上D/d1者为初筛入选菌株。复筛 5.6.1 纤维 素酶 活
6、性 测定 5.6.1.1 原理 采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶催化羧甲基纤维素钠（CMC-Na）降解产生的还原糖的含量，从而确定纤维素酶活性。酶活定义：在 pH 5.0、50 条件下，每 1 mL纤维素粗酶液在 1 min 内水解 CMC-Na 生成 1 g 的葡萄糖，称为1个 CMC 酶活力单位（U）。5.6.1.2 方法 取 10 mg 无水葡萄糖标准品，加入1 mL超纯水配制成 10 mgmL-1 葡萄糖溶液，再分梯度稀释为 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0 mgmL-1。在540 nm处以0 mgmL-1 调零，读取各浓度梯度吸光值，以葡萄糖浓度为横
7、坐标、吸光度为纵坐标建立标准曲线。将50的CMC-Na缓冲溶液和 50 L粗酶液样品组成 350 L反应体系，50 保温 30 min，反应后煮沸 5 min 终止反应获得糖化液，取50 L 糖化液，加入 150 L DNS 试剂混匀，再加入 1050 L 双蒸水，于紫外分光光度计下 540 nm 处测定吸光度。依据标准曲线计算糖化液的浓度。5.6.1.3 结 果计 算 纤维素酶活性按公式(1)计算：CL=1000XV反总（500V样V样总）T(1)式中：CL 纤维素酶活性（U mL-1)）X样品浓度（mgmL-1）V反总-反应总体积（mL）V样-反应样品体积（mL）V样总 加入样品总体积（m
8、L）T：反应时间（min）5.6.2 Lip 活性 测定 5.6.2.1 原理 木质素过氧化物酶氧化藜芦醇生成藜芦醛，在310 nm处有特殊吸收峰。酶活性定义为每升培养每min内氧化1 nmol藜芦醇所需酶量为一个酶活力单位（U）。藜芦醛摩尔消光系数=9300 L mol-1 cm-1。5.6.2.2 方法 DB 13/T 55722022 3 采用木质素过氧化物酶活性检测试剂盒检测。将菌株发酵培养液超声波冰浴破碎菌体，然后10000 g离心10 min，取上清液100 L装入2 mL离心管中，放置于冰上待测。反应体系含有1 mM 藜芦醇，50 mM pH 7.2的磷酸缓冲液（PBS）和 0.
9、1 mM过氧化氢，总体积1 mL。超纯水作为对照，分别测定310 nm处反应10 S和310 S的吸光值，分别记为A1和A2，A=A2-A1。5.6.2.3 结 果计 算 木质素过氧化物酶活性按公式(2)计算：Lip=A(d)V总V样T(2)式中：Lip 木质素过氧化物酶活性（nmol min-1 L-1）A 反应前后吸光值之差-藜芦醛摩尔消光系数（L mol-1 cm-1）d-比色杯光径（cm）V总-反应总体积（mL）V样-反应样品体积（mL）T-反应时间（min）5.6.3 Mnp 活性 测定 5.6.3.1 原理 在 Mn2+存在的条件下将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，在465 nm处有
10、特征吸收峰。酶活性定义为每升培养液每分钟氧化1 nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。愈创木酚消光系数=12100 L mol-1 cm-1。5.6.3.2 方法 使用木质素锰过氧化物酶活性检测试剂盒进行测定。将发酵培养液10000 g离心10 min，取上清液作为粗酶液放置于冰上待测。反应样品100 L，底物反应体系900 L，充分混匀反应体系与样品，在37 反应10 min，于1 mL玻璃比色皿中，蒸馏水调零，测定465 nm处吸光值，计算与对照组差值 A。5.6.3.3 结 果计 算 木质素锰过氧化物酶活性按公式(3)计算：Mnp=A(d)V总V样T(3)式中：Mnp 木质素锰过氧
11、化物酶活性（nmol min-1 L-1）-愈创木酚摩尔消光系数（L mol-1 cm-1）A、d、V总、V样、T 参照 5.6.2.3 5.6.4 Lac 活性 测定 5.6.4.1 原理 漆酶分解ABTS产生ABTS自由基，在420 nm处吸光系数远大于ABTS，测定ABTS自由基增长率得到漆酶活性。定义每毫升每分钟氧化1 nmol底物ABTS 时所需的酶量为一个酶活单位。ABTS消光系数=36 L mmol-1 cm-1。5.6.4.2 方法 使用漆酶活性检测试剂盒测定。离心后粗酶液0.1 mL，加入反应体系液0.6 mL，对照组样品煮沸后加入。样品加入后在60 水浴3 min，测定其4
12、20 nm处吸光值，计算与对照组的差值 A。5.6.4.3 结 果计 算 漆酶活性按公式(4)计算：DB 13/T 55722022 4 Lac=A(d)V总V样T(4)式中：Lac 漆酶活性(U L-1)-ABTS消光系数（L mmol-1 cm-1）A、d、V总、V样、T 参照 5.6.2.3 5.6.5 秸秆 降解 率测 定 5.6.5.1 原理 秸秆降解率的测定是在一定反应体系和条件下检测反应后秸秆降解量与反应前秸秆质量的比值，一般用百分比表示，它反映了降解菌及其酶系对木质纤维类物质的综合分解能力。5.6.5.2 方法 将玉米秸秆粉碎后于105 烘干至恒重，配制秸秆降解培养基，备用。将
13、初筛入选菌株接种于相应的菌种扩繁培养基，在35、150 r/min摇瓶培养24 h72 h；取菌悬液按2%接种率接种到装有150 mL秸秆降解培养基的250 mL锥形瓶中，35 摇床培养5 d。培养结束后，在锥形瓶中加入装液量20%的中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠），煮沸10 min以便除去可溶性物质。将培养液用质量恒定（m0）滤纸进行过滤，经蒸馏水冲洗过滤后，将滤纸和滤渣置于105 烘箱中干燥至恒重（m2）。质量恒定后的m2 m0即为降解剩余物质量m1。5.6.5.3 结 果计 算 秸秆木质纤维素降解率按公式(5)计算：Y=(m-m1)/m100%(5)式中：Y-秸秆木质纤维素降解率（%）m
14、-培养基中初始秸秆干物质的质量（g）。m1-秸秆降解后残余干物质的质量（g）。5.6.6 对 比分 析 对各菌株的酶活性值和秸秆降解率进行比较，满足指标CMCase5 U/mL、Lip6 U/mL、Mnp4 U/mL、Lac3 U/mL和秸秆降解率30%之一及以上者为复筛入选菌株。6 剩余样 品处 理 剩余样品的生物安全处理应符合GB 7959-87和GB 15618-2018的规定。DB 13/T 55722022 5 A A 附录A（资料 性）培养基 制备 A.1 木质纤 维素 富集 培养 基 A.1.1 配方 秸秆末（滤纸浆粉）5 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，CaCO3 2 g，
15、K2HPO4 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，蒸馏水1000 mL。A.1.2 制备 按配方比例配制，分装锥形瓶，置于高压锅内121 灭菌30 min，冷却备用。A.2 CMC 刚 果红 培养 基 A.2.1 配方(NH4)2SO4 2.0 g，MgSO4 7H2O 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，NaCl 0.5 g，CMC-Na 2.0 g，琼脂 20.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。A.2.2 制备 培养基配制和灭菌方法参照 A.1.2。若制做平板培养基，应待培养基冷却至55 60 时，无菌操作倒入培养皿适量，凝固后备用。后续染色需配制1 mg/mL刚果红染
16、液和1 mol/L NaCl溶液。A.3 木质素 苯胺 蓝培 养基 A.3.1 配方(NH4)2SO4 2 g/L，K2HPO4 1 g/L，MgSO4 7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，碱性木质素5 g/L，琼脂粉22 g/L，蒸馏水950 mL。A.3.2 制备 培养基配制和灭菌方法参照 A.1.2。无菌操作将苯胺蓝粉末 0.25 g 溶于50 mL无菌水中，用一次性医用注射器吸取苯胺蓝染液，在注射端装上无菌过滤器，将除菌后的苯胺蓝染液注入灭菌后的培养基中，趁热混合均匀。平板培养基制做方法参照 A.2.2。A.4 木质素 亮蓝 培养 基 A.4.1 配方(NH4)2SO4 2 g/L，K2HPO4 1 g/L，MgSO4 7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，碱性木质素5 g/L，亮蓝0.25 g，琼脂粉22 g/L，H2O 1 L。A.4.2 制备 培养基配制、灭菌、亮蓝过滤除菌和平板培养基制做方法参照 A.3.2。A.5 秸秆降 解培 养基 A.5.1 配方 玉米秸秆粉2%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，(NH4)2SO4 0.4%，KH2PO4 0.2%，MgSO4 7H2O 0.05%，pH值7.27.4。A.5.2 制备 培养基配制和灭菌方法参照 A.1.2。
