1、 ICS 11.220 CCS B 41 13 河北省地方标准 DB 13/T 55842022 兔须癣毛 癣菌诊断 与防治技 术规程 2022-05-31 发布 2022-07-01 实施 河北省市 场 监督 管 理局 发 布 DB 13/T 5584 2022 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标 准化 文件 的结 构 和起草 规则 的规定起草。本文件 由河 北省 农业 农村 厅提出。本文件 起草 单位：河 北工 程大学。本标准主要起草人：柳焕 章、刘建钗、于国杰、刘 利强、刘会洽、杜鹃、刘 彦威、刘娜、崔国林、刘 艳莉、吴 志勇、崔 玉
2、革、李晶 晶、娄路 平、李夫宏、刘 孟啸、赵 梓筱。DB 13/T 5584 2022 1 兔 须癣毛 癣菌诊断 与防治 技术规程 1 范围 本文件 规定 了兔 须癣 毛癣 菌病的 临床 诊断、实 验室 诊断和 综合 判定。本文件 适用 于兔 类、牛、羊、犬、猫 等 须 癣毛 癣菌 病的 诊断及 其须 癣毛 癣菌 病原 的检测 和防 治。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应 用是必不可少的。凡是注 日期的引用文件，仅注日 期的版本适用于本文件。凡是 不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用于 本文件。DB51/T 1419-2012 大熊 猫须癣 毛癣
3、 菌病 检验 技术 规范 3 术语和 定义 须癣毛 癣菌 Trichophyton mentagrophytes 为人畜 共患 的皮 肤真 菌。4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。PDA：马铃 薯葡 萄糖 琼脂 培 养基；TSA：胰蛋 白胨 大豆 琼脂 培 养基；YEPD：酵母 浸出 粉胨 葡萄 糖培养 基；DMSO：二甲 基亚 砜；5 临床诊 断 当兔出 现以 下部 分或 全部 情形时，可 作为 初步 诊断 的依据。临床症 状 感染的兔皮肤出现瘙痒、脱毛和皮肤炎症，以头部、四肢部位最多。各种年 龄的兔均可感染。病理变 化 病变部 位因 脱毛 而露 出粉 红色的 皮肤 并发 炎，有的
4、出现结 痂，有的 结痂 下面 出现化 脓性 炎症。6 实验室 诊断 包括常 规检 测和 定量PCR 检 测技术。常规检 测 6.1.1 样品采 集 将患皮 癣病 的兔，用75%酒 精对患 处消 毒，取无 菌手 术刀刮 取患 处及 边缘 的皮 屑、痂 皮和 被毛 等病料，放入 无菌 的离 心管 中于冷 藏保 存。6.1.2 病原菌 的分 离纯 化与 形态 观察 把采集的病料接种到沙氏培养基（含0.5 mg/mL 氯霉 素）平板，放入27真菌培养箱培养10 d，观察菌 落生 长情 况菌 落特 征，并 涂片 镜检，确 定纯 化后保 存备 用。对照兔 须癣 毛癣 菌菌 典型 菌落形 态和 菌体 形态
5、特征 进行初 步鉴 别（参见 附录A）。DB 13/T 5584 2022 2 6.1.3 病料显 微镜 检查（改 良 的KOH 法）取少量 病料（皮 屑、被毛 等），放在 清洗 干净 的载 波片上，滴 加改 良复 方KOH 溶液（KOH 15 g 加入30 mL 蒸馏 水中 溶解 后，依次加 入DMSO 40 mL，甘油20 mL，摇匀 后加 入蒸 馏 水至1000 mL 混 匀）1 2滴，加盖 玻片，用 滤纸 吸 净周边 溢液，在 显微 镜下 镜检。结果判断：将同种病料 连 续重复两次检查，以病料 中查到特征性菌丝和孢子 为阳性结果，以检查不到 菌丝 和孢 子为 阴性。定量PCR 检测 6
6、.2.1 样品采 集 从发病的兔场选择有典型 皮肤真菌病的家兔，在病 变与健康皮肤组织交界处，用无菌手术刀片刮取皮 屑，放入 灭菌 的平 皿中冷 藏保 存。6.2.2 基因 组DNA 提取 使用真 菌DNA 提 取试 剂盒 提 取。6.2.3 引物合 成 参照GenBank 中 兔须 癣毛 癣 菌benAfum 基因 转录 间隔 区 序列（KP099602），使用Primer Express 6.0软 件设 计特 异性 引物（预期扩 增片 段大 小140bp）：上游引 物F：（5-GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3）下游引 物R：(5-GGAGACCATCTGTGAGAGTT-3)6
7、.2.4 定量PCR 反 应体 系和 反应 程序 采用25 L的 反应 体系：SYBR Premix Ex Taq（2）12.5 L，上、下 游引 物各0.5 L，DNA 模板1.0 L，用双 蒸水 补足 至25 L。反 应程 序为：94 预变性60 S；94 10 S，60 30 S，72 30 S，进 行40 个循 环。反应 结 束后，作熔 解曲 线，采用 软件自 动分 析。6.2.5 结果判 断 当待测样品实时荧光定量PCR 检测结果有“S”型扩增曲线，Ct 值 36.5，且Tm 值介于86.48 86.65 之 间时，判 定待 测 样品中 含有 须癣 毛癣 菌。未出现 扩增 曲线 和T
8、m 值，则判断 样品 中不 含须 癣毛癣菌。7 综合判 定 结合临 床诊 断、实验 室检 测结果，可 确诊 兔须 癣毛 癣菌病。8 综合防 治 预防措 施 环境病原菌的净化。可采 用火焰喷杀或火碱等消毒 产品的喷洒，保持兔舍和 运动场宽敞，阳光充足；保持垫料清洁干燥，发现病兔及时隔离或移 除。科学饲养管理，提高 兔群的免疫力和抗病能力。治疗措 施 根据药敏试验结果，选择 敏感抗真菌药物治疗。对 病兔的药物治疗宜采用内 服与外敷相结合的方法。DB 13/T 5584 2022 3 A A 附录A（资料 性）须癣毛 癣菌 形态 学判 断 A.1 须癣毛 癣菌 形态 学判 断 须癣毛 癣菌 菌落 形态 特征 为：在PDA 培 养基 上，菌落 为白色，中央 致密 稍凸 起，周 围较 松散，背面为黄褐色。符合须癣毛 癣菌菌丝和孢子的显微形 态特征为：在显微镜下可 见典型的螺旋菌丝，小分生孢子较多，呈葡萄状；大分生孢子较少，呈棒 状，有分隔。由菌落形态 及菌体镜检结果可初步判断其 为须 癣毛 癣菌。
