1、DB53/T 1 0 7 3 2 0 2 1 甘 蔗 杂 交 育 种 独 立 亲 本 系 统 的 创 制 及 培 育 技 术 规 程 2 0 2 1 - 1 2 - 1 0 发 布 2 0 2 2 - 0 3 - 1 0 实 施 ICS 6 5 . 0 2 0 CCS B 0 5 云 南 省 地 方 标 准 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 53D B 5 3 / T 1 0 7 3 2 0 2 1 I 前 言 本 文 件 按 照 G B / T 1 . 1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规
2、 定 起 草 。 请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。 本 文 件 由 云 南 省 农 业 科 学 院 甘 蔗 研 究 所 提 出 。 本 文 件 由 云 南 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ Y N T C 0 7 ） 归 口 。 本 文 件 起 草 单 位 ： 云 南 省 农 业 科 学 院 甘 蔗 研 究 所 。 本 文 件 主 要 起 草 人 ： 吴 才 文 、 胡 鑫 、 刘 家 勇 、 赵 俊 、 杨 昆 、 夏 红 明 、 赵 培 方 、 昝 逢 刚 、 刘
3、 新 龙 、 苏 火 生 、 董 立 华 、 经 艳 芬 、 田 春 艳 、 覃 伟 、 陆 鑫 、 吴 转 娣 、 姚 丽 、 桃 联 安 、 赵 丽 萍 、 赵 勇 、 陈 学 宽 。D B 5 3 / T 1 0 7 3 2 0 2 1 1 甘 蔗 杂 交 育 种 独 立 亲 本 系 统 的 创 制 及 培 育 技 术 规 程 1 范 围 本 文 件 规 定 了 甘 蔗 杂 交 育 种 独 立 亲 本 系 统 创 制 中 涉 及 的 优 良 性 状 界 定 、 独 立 亲 本 系 统 创 制 及 独 立 亲 本 系 统 培 育 等 技 术 要 求 。 本 文 件 适 用 于 甘 蔗 杂
4、交 育 种 新 独 立 亲 本 系 统 的 创 制 与 培 育 。 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 D B 5 3 / T 7 3 4 甘 蔗 实 生 苗 培 育 技 术 规 程 3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义
5、适 用 于 本 文 件 。 3 . 1 甘 蔗 属 原 种 o r i g i n a l a n c e s t o r o f S a c c h a r u m L . 甘 蔗 属 内 未 经 过 人 工 杂 交 及 驯 化 ， 保 持 原 有 种 性 的 栽 培 原 种 及 野 生 种 简 称 甘 蔗 属 原 种 。 本 规 程 甘 蔗 属 栽 培 原 种 包 括 热 带 种 （ S . o f f i c i n a r u m ） 、 中 国 种 （ S . s i n e n s e ） 和 印 度 种 （ S . b a r b e r i ） 3 个 种 ， 甘 蔗 属 野
6、生 种 包 括 割 手 密 （ S . s p o n t a n e u m ） 和 大 茎 野 生 种 （ S . r o b u s t u m ） 2 个 种 。 3 . 2 新 原 种 n e w o r i g i n a l a n c e s t o r o f S a c c h a r u m L . 不 包 含 在 世 界 公 认 的 P O J 2 8 7 8 和 C o 2 9 0 亲 本 系 统 中 的 甘 蔗 属 栽 培 原 种 9 个 无 性 系 （ B . H i t a n 、 B . C h e r i b o n 、 C h u n n e e 、 C
7、r y s t a l i n a 、 L a h a i n a 、 L o e t h e r s 、 F i J i 、 K . B o o t h a n 、 W . T r a n s p a r e n t ） 和 野 生 种 2 个 无 性 系 （ S . s p o n t / C o 、 S . s p o n t / G ） ， 其 余 所 有 原 种 个 体 均 称 为 新 原 种 。 3 . 3 异 质 率 h e t e r o g e n e i t y r a t e 新 独 立 亲 本 系 统 与 现 有 P O J 2 8 7 8 和 C o 2 9 0 系
8、统 比 较 ， 采 用 系 谱 法 计 算 使 用 的 新 原 种 的 数 量 占 系 统 中 甘 蔗 属 原 种 数 的 百 分 率 。 3 . 4 杂 交 伴 侣 p a r t n e r 不 同 无 性 系 个 体 之 间 进 行 的 杂 交 ， 杂 交 的 双 方 互 为 杂 交 伴 侣 。 3 . 5 性 状 互 补 c h a r a c t e r c o m p l e m e n t a t i o n 指 亲 本 一 方 的 优 点 应 在 很 大 程 度 上 弥 补 另 一 亲 本 的 缺 点 ， 便 于 创 制 出 具 有 双 亲 优 良 性 状 的 子 代 ， 如
9、高 产 与 高 糖 、 中 大 茎 与 多 茎 、 大 茎 与 多 茎 、 抗 病 与 抗 虫 等 。D B 5 3 / T 1 0 7 3 2 0 2 1 2 4 优 良 性 状 界 定 早 熟 、 高 产 、 高 糖 、 中 大 茎 、 大 茎 、 有 效 茎 中 等 以 上 ， 抗 病 、 抗 虫 和 抗 逆 等 达 中 抗 以 上 ， 具 体 要 求 见 表 1 。 表 1 优 良 性 状 早熟 高产 高糖 茎径（c m ） 茎数（茎） 抗性 成 熟初期 1 1 月1 2 月甘蔗平均糖分达 1 3 . 5 % 单位面积比对照种 增产 5 % 及以上 甘蔗蔗糖分比对照 增加 0 . 5
10、个百分点及 以上 2 . 5 中大茎 3 . 0 大茎 3 . 0 3 中等 4 多茎 5 主要病虫害（黑穗 病、锈病、花叶病、 稍腐病等， 蚜虫、 螟 虫、粘虫、蓟马等） 及逆境 （旱害、 冻 害 及寒害等） 达中抗 及 以上。 5 独 立 亲 本 系 统 创 制 5 . 1 新 原 种 的 选 择 选 择 至 少 具 有 一 个 优 良 性 状 的 新 原 种 。 5 . 2 杂 交 伴 侣 的 选 配 5 . 2 . 1 母 本 与 父 本 栽 培 原 种 间 杂 交 ， 以 优 良 性 状 多 的 为 母 本 ， 优 良 性 状 较 少 的 为 父 本 。 甘 蔗 属 内 栽 培 原
11、种 与 野 生 种 杂 交 ， 以 栽 培 原 种 为 母 本 ， 以 性 状 互 补 性 好 的 野 生 种 为 父 本 。 5 . 2 . 2 亲 本 血 缘 比 例 提 供 生 产 亲 本 ， 野 生 血 缘 比 例 不 超 过 2 5 % 。 如 提 供 生 产 利 用 的 亲 本 为 F 2 代 种 时 ， 其 4 个 原 种 中 最 多 有 1 个 为 野 生 种 ； 若 提 供 生 产 利 用 的 亲 本 为 F 3 代 种 时 ， 其 8 个 原 种 中 最 多 有 2 个 为 野 生 种 。 5 . 3 对 等 杂 交 杂 交 伴 侣 各 自 所 含 原 种 数 量 及 其
12、遗 传 代 数 完 全 相 等 的 杂 交 ， 方 法 如 下 ： a ) 原 种 与 原 种 间 杂 交 产 生 的 高 贵 化 F 1 代 种 ； b ) 高 贵 化 F 1 代 相 互 杂 交 （ F 1 F 1 ） ， 获 得 更 高 贵 化 的 F 2 代 种 ； c ) 以 此 类 推 ， 获 得 F 3 代 或 更 高 代 种 的 杂 交 方 式 。 5 . 4 独 立 亲 本 系 统 确 定D B 5 3 / T 1 0 7 3 2 0 2 1 3 对 等 杂 交 培 育 产 生 的 新 独 立 亲 本 系 统 所 含 新 原 种 与 传 统 的 P O J 2 8 7 8 和
13、 C o 2 9 0 系 统 没 有 或 极 少 重 复 ， 异 质 率 达 8 0 % 及 以 上 ， 遗 传 性 稳 定 、 优 良 性 状 多 的 F 2 及 以 上 代 数 的 亲 本 系 统 。 6 独 立 亲 本 系 统 培 育 6 . 1 母 本 杀 雄 5 0 水 浴 3 m i n 5 m i n 杀 雄 ， 不 应 自 交 。 6 . 2 隔 离 遮 蔽 或 罩 住 杂 交 伴 侣 整 个 花 穗 （ 1 . 5 m 2 . 0 m 高 ） ， 不 应 串 粉 。 6 . 3 杂 交 在 隔 离 罩 中 将 父 本 花 穗 置 于 母 本 上 方 ， 母 本 花 穗 顶 部
14、 置 于 父 本 花 穗 下 半 部 约 1 / 3 处 1 / 2 处 ， 每 日 轻 摇 父 本 2 次 3 次 授 粉 。 6 . 4 实 生 苗 培 育 参 照 D B 5 3 / T 7 3 4 执 行 。 6 . 5 后 代 选 择 对 各 级 杂 交 获 得 的 种 子 培 育 实 生 苗 ， 经 田 间 试 验 评 价 ， 在 含 有 亲 本 主 要 特 性 的 前 提 下 ， 选 择 优 良 性 状 多 的 个 体 。 6 . 6 真 实 性 鉴 定 采 用 简 单 序 列 重 复 （ S i m p l e s e q u e n c e r e p e a t , S S
15、 R ） 分 子 标 记 技 术 ， 进 行 真 实 性 鉴 定 ， 方 法 参 见 附 录 A 。 6 . 7 利 用 已 经 通 过 真 实 性 鉴 定 ， 达 到 遗 传 性 稳 定 、 工 农 艺 性 状 和 抗 性 性 状 要 求 指 标 的 材 料 ， F 2 代 就 可 用 于 选 配 杂 交 组 合 ， 提 供 甘 蔗 育 种 单 位 培 育 新 品 种 利 用 。D B 5 3 / T 1 0 7 3 2 0 2 1 4 附 录 A （ 资 料 性 ） 甘 蔗 杂 交 后 代 S S R 真 实 性 鉴 定 方 法 A . 1 仪 器 、 耗 材 A . 1 . 1 仪 器
16、主 要 仪 器 包 含 电 子 天 平 、 酸 度 计 、 可 调 微 量 移 液 器 、 恒 温 水 浴 锅 、 高 速 台 式 冷 冻 离 心 机 、 蛋 白 / 核 酸 分 析 仪 、 P C R 扩 增 仪 、 涡 旋 混 匀 器 、 微 波 炉 、 电 泳 仪 、 水 平 电 泳 槽 、 凝 胶 成 像 仪 、 研 钵 等 。 A . 1 . 2 试 剂 主 要 试 剂 包 括 十 六 烷 基 三 乙 基 溴 化 铵 （ C T A B ） 、 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ T r i s ） 、 盐 酸 、 氢 氧 化 钠 、 氯 化 钠 、 三 氯 甲 烷 、 无 水 乙
17、醇 、 异 丙 醇 、 异 戊 醇 、 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 、 琼 脂 糖 、 - 巯 基 乙 醇 （ - M e r c a p t o e t h a n o l ） 、 丙 烯 酰 胺 、 双 甲 叉 丙 烯 酰 胺 、 T E M E D 、 过 硫 酸 铵 、 D N A 分 子 量 标 准 、 d N T P 混 合 液 、 E x - T a q D N A 聚 合 酶 、 1 0 E x - B u f f e r 、 S S R 引 物 等 。 A . 2 真 实 性 鉴 定 方 法 A . 2 . 1 参 试 样 本 采 集 每 份 亲 本 和 杂 种 后 代
18、材 料 取 4 0 0 m g 幼 嫩 叶 片 组 织 ， 放 入 2 m L 离 心 管 中 ， 样 品 直 接 提 取 D N A 或 保 存 于 - 8 0 冰 箱 备 用 。 A . 2 . 2 C T A B 法 提 取 样 本 D N A C T A B 提 取 样 本 D N A 方 法 如 下 ： a ) 将 甘 蔗 叶 片 剪 成 1 c m 左 右 碎 片 ， 放 入 预 冷 的 研 钵 中 。 加 入 液 氮 速 冷 ， 研 磨 成 粉 末 ， 将 冻 粉 转 移 至 2 m L 离 心 管 中 ； b ) 向 装 有 冻 粉 的 离 心 管 中 加 入 等 体 积 (
19、w / v ) 2 C T A B 提 取 缓 冲 液 抽 提 缓 冲 液 ， 6 5 水 浴 2 0 m i n ， 间 隔 4 m i n 颠 倒 混 匀 。 c ) 将 样 品 于 1 2 0 0 0 r p m 下 离 心 5 m i n ， 吸 取 上 清 液 转 入 新 的 2 m L 离 心 管 中 ； d ) 加 入 等 体 积 的 氯 仿 - 异 戊 醇 ， 轻 缓 颠 倒 离 心 管 ， 充 分 混 匀 ， 1 2 0 0 0 r p m 离 心 1 0 m i n ； e ) 吸 取 上 清 液 转 入 新 的 离 心 管 中 ， 加 入 2 / 3 倍 体 积 的 预
20、冷 异 丙 醇 , 轻 缓 颠 倒 混 匀 后 置 - 2 0 冰 箱 2 0 m i n ； f ) 取 样 品 管 ， 此 时 可 见 有 絮 状 D N A 沉 淀 ， 1 2 0 0 0 r p m 离 心 1 0 m i n ， 弃 上 清 液 。 D N A 沉 淀 用 7 5 乙 醇 漂 洗 2 次 ， 1 2 0 0 0 r p m 离 心 1 m i n 后 弃 上 清 液 ， 于 室 温 下 干 燥 5 m i n ； g ) 加 入 6 0 L 1 T E 缓 冲 液 溶 解 D N A ， 可 取 2 L D N A 溶 液 用 1 % 琼 脂 糖 电 泳 检 测 。
21、提 取 的 D N A 溶 液 置 于 - 2 0 冰 箱 保 存 备 用 。 A . 2 . 3 建 立 S S R - P C R 反 应 体 系 和 电 泳 检 测 按 下 列 方 法 建 立 S S R - P C R 反 应 体 系 和 电 泳 检 测 ： a ) 利 用 现 代 甘 蔗 商 业 品 种 、 中 国 种 、 印 度 种 、 割 手 密 、 大 茎 野 生 种 等 D N A 做 为 模 板 ， 对 选 择 的 7 0 对 S S R 引 物 进 行 多 态 性 分 析 ， 选 择 多 态 性 高 、 稳 定 性 好 的 4 对 引 物 ， 详 见 表 A . 1 。D
22、 B 5 3 / T 1 0 7 3 2 0 2 1 5 表 A . 1 S S R 真 实 性 鉴 定 引 物 的 序 列 信 息 序号 S S R M a r k e r F o r w a r d ( 5 t o 3 ) R e v e r s e ( 5 t o 3 ) 1 S M C 3 3 4 B S C A A T T C T G A C C G T G C A A A G A T C G A T G A G C T T G A T T G C G A A T G 2 S M C 3 3 6 B S A T T C T A G T G C C A A T C C A T C T
23、C A C A T G C C A A C T T C C A A A C A G A C 3 m S S C I R 7 4 G C G C A A G C C A C A C T G A G A A C G C A A C G C A A A A C A A C G 4 m S S C I R 3 A T A G C T C C C A C A C C A A A T G C G G A C T A C T C C A C A A T G A T G C b ) P C R 反 应 体 系 和 条 件 : P C R 扩 增 反 应 体 系 （ 总 体 积 2 0 L ） 中 各 组 分
24、的 终 浓 度 和 体 积 参 照 表 A . 2 进 行 配 制 ， 可 以 依 据 试 验 条 件 不 同 做 相 应 调 整 ； 表 A . 2 S S R - P C R 反 应 体 系 试剂 终浓度 体积 ( L ) 1 0 E x - B u f f e r 1 2 . 0 d N T P （2 . 5 m m o l / L ） 0 . 2 5 m m o l / L 2 . 0 上游引物（4 m o l / L ） 0 . 2 m o l / L 1 . 0 下游引物（4 m o l / L ） 0 . 2 m o l / L 1 . 0 D N A 模板 约 2 0 n g
25、/ L 1 . 0 E x - T a q 酶 ( 5 U / L ) 0 . 0 5 U / L 0 . 2 d d H 2 O 1 2 . 8 P C R 的 反 应 程 序 参 照 表 A . 3 ， 其 中 退 火 温 度 依 据 不 同 引 物 的 T m 值 作 相 应 调 整 ， P C R 程 序 结 束 后 扩 增 产 物 于 4 保 存 。 表 A . 3 S S R - P C R 反 应 条 件 程序 终浓度 体积 ( L ) 预变性 9 4 3 m i n 扩增 （3 5 c y c l e ） 变性 9 4 3 0 s 退火 5 2 6 5 3 0 s 延伸 7 2
26、 4 0 s 终延伸 7 2 5 m i n A . 2 . 4 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 检 测D B 5 3 / T 1 0 7 3 2 0 2 1 6 按 以 下 方 法 进 行 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 检 测 ： a ) 制 备 8 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 （ P A G E ） 溶 液 （ 见 附 件 B ） ， 缓 慢 混 合 均 匀 后 倒 入 制 胶 板 ， 插 入 样 品 梳 子 后 静 置 3 0 m i n 左 右 ； b ) 向 电 泳 槽 中 加 1 T B E 缓 冲 液 ， 液 面 超 过 样 品 孔 1 c m 左 右 ， 拔 出
27、样 品 梳 子 ， 向 样 品 孔 中 加 入 2 L 的 S S R 扩 增 产 物 。 电 泳 条 件 1 1 0 V 恒 定 电 压 电 泳 时 间 2 h ； c ) P C R 产 物 在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 上 电 泳 分 离 后 采 用 银 染 方 法 进 行 染 色 。 先 用 d d H 2 O 漂 洗 两 次 ， 每 次 2 m i n ， 用 0 . 1 硝 酸 银 溶 液 染 色 1 0 m i n ， 再 用 d d H 2 O 漂 洗 2 m i n ， 然 后 将 胶 转 移 到 显 影 液 中 显 色 1 0 m i n ， 直 至 条 带 清 晰 ，
28、最 后 用 d d H 2 O 漂 洗 两 次 。 A . 3 检 测 结 果 分 析 与 鉴 定 A . 3 . 1 针 对 每 一 对 S S R 引 物 ， 将 其 扩 增 出 来 所 有 条 带 根 据 分 子 量 的 大 小 依 次 编 号 为 1 、 2 、 3 、 4 。 A . 3 . 2 然 后 对 每 个 泳 道 依 据 条 带 编 号 进 行 标 志 ， 图 中 有 清 晰 条 带 的 记 为 1 ， 同 一 位 置 无 带 的 记 为 0 ， 统 计 条 带 的 结 果 建 立 原 始 数 据 矩 阵 。 A . 3 . 3 利 用 E x c e l 将 数 据 矩
29、阵 中 1 转 换 为 黑 色 方 块 ， 将 0 转 换 为 白 色 方 块 ， 统 计 杂 交 后 代 的 带 型 与 父 母 本 带 型 差 异 性 ， 结 合 4 对 引 物 的 结 果 作 为 判 定 甘 蔗 后 代 真 实 性 的 重 要 依 据 。 A . 3 . 4 依 S M C 3 3 4 B S 引 物 鉴 定 热 带 种 （ 母 本 ） 与 割 手 密 （ 父 本 ） 的 杂 交 后 代 为 例 ， 详 见 图 A . 1 。 A . 3 . 5 按 照 表 格 统 计 各 参 试 材 料 的 D N A 带 型 ， 其 中 条 带 1 、 2 、 3 、 4 和 5
30、是 母 本 特 有 D N A 条 带 ， 8 、 9 、 1 0 和 1 1 为 父 本 特 有 条 带 ， 6 为 父 母 本 共 有 条 带 ， 7 为 后 代 新 增 条 带 。 A . 3 . 6 将 结 果 类 型 分 为 四 类 ， 第 一 类 为 与 父 本 或 者 母 本 条 带 一 致 ， 标 记 为 1 ， 代 表 亲 本 ； 第 二 类 为 同 时 含 有 一 个 或 多 个 父 母 本 特 有 条 带 同 时 无 新 增 条 带 ， 标 记 为 2 ， 代 表 真 实 杂 交 后 代 ； 第 三 类 为 不 含 有 任 何 父 本 特 异 条 带 ， 含 有 一 个 或 多 个 母 本 条 带 ， 标 记 为 3 ， 代 表 自 交 后 代 ； 第 四 类 为 出 现 父 母 本 均 不 含 有 的 新 增 条 带 ， 标 记 为 4 ， 代 表 假 杂 交 后 代 。 注: 鉴定结果 1 , 亲本; 2 , 真实杂交后代; 3 , 自 交后代 ; 4 , 假杂交后代。 图 A . 1 S S R - P C R 鉴 定 结 果 统 计 分 析DB53/T 1 0 7 3 2 0 2 1
