1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广东 省 地方标准 DB44/T 2337 2021 实验动物 病原菌PCR 定性分析 Laboratory animals Qualitative analysis of pathogenic bacteria with polymerase chain reaction method 2021 - 10 - 18 发布 2022 - 01 - 18 实施 广东省市 场监督 管 理局 发 布 DB44/T 2337 2021 I 目 次 . II 1 . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 .
2、3 9 . 6 10 . 7 A . 8 B . 10 . 13 DB44/T 2337 2021 II 前 言 GB/T 1.1 2020 1 GD/TC 93 DB44/T 2337 2021 1 实 验动物 病 原菌 PCR 定性 分析 1 范围 PCR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB/T 14926 GB 19489 GB/T 19495.2 3 术语和 定义 聚合酶 链式 反应 polymerase chain reaction ，PCR DNA DNA DNA DNA DNA dNTP 实时荧 光聚 合酶 链式 反应 real-time PCR ，实 时荧 光 P
3、CR PCR PCR PCR PCR Ct 值 cycle threshold PCR 4 缩略语 DNA deoxyribonucleic acid EDTA ethylenediamine tetraacetic acid DB44/T 2337 2021 2 PBS phosphate buffered saline RNA ribonucleic acid TAE - - tris-acetate-EDTA 5 原理 DNA 16s RNA PCR PCR 6 主要设 备和 材料 PCR PCR PCR -20 1.5 mL 2 mL 5 mL 15 mL 1 mL PCR 0.2 m
4、L 96 90 mm 150 mm 20 min 7 试剂 GB/T 6682 DNA RNA PBS A DNA DNA DNeasy Blood & Tissue Kit 注： DNA Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit DNA PCR Premix Taq TM Version 2.0 plus dye Premix Ex Taq Probe qPCR DB44/T 2337 2021 3 注： PCR Takara PCR DNA 100 bp 2 000 bp 50 TAE A 10 mg/mL A 1.5% A B B.1 B.2 DNA RNA -2
5、0 4 8 方法 生物安 全措 施 GB 19489 采样及 样本 的处 理 8.2.1 脏器组 织 0.5 g 2 g 5 PBS 1 min 2 min 4 8 000 g 10 min 5 mL 8.2.2 细菌培 养物 GB/T 14926 1 mm 2 3 mm 2 8 000 g 1 min PCR 8.2.3 盲肠内 容物 或粪 便 0.5 g 2.0 g 5 PBS 1 min 2 min 8 000 g 5 min 8.2.4 血液样 本 0.2 mL 0.5 mL EDTA 3 5 8.2.5 拭子取 样 3 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5
6、min 5 mL DB44/T 2337 2021 4 8.2.6 饲料、 垫料 和饮 水 5 g 10 g 50 mL 3 PBS 5 min 10 min 15 mL 4 8 000 g 5 min 5 mL 200 1.5 mL 8.2.7 设施设 备 5 cm 2 15 mL 3 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5 min 8.2.8 样本的 存放 2 8 24 h -80 8.2.9 采样废 弃物 处理 核酸提 取 8.3.1 50 L 100 L 1.5 mL 2 mL 20 L K PBS 220 L 8.3.2 AL 56 10 min 8.3.3
7、8.3.4 8.3.3 2 mL 6 000 g 1 min / 8.3.5 2 mL AW1 6 000 g 1 min / 8.3.6 2 mL AW2 20 000 g 3 min / 8.3.7 1.5 mL AE 1 min 6 000 g 1min DNA 8.3.8 DNA DNA 8.3.9 DNA PCR PCR -20 注： DNA DNA DNeasy Blood & Tissue Kit DNA 普通PCR 8.4.1 PCR 反 应体 系 PCR 1 DB44/T 2337 2021 5 No Template Control NTC 表1 PCR 反 应体 系配 制
8、表 L 2 Premix Taq Mix plus dye 10 1 Forward primer 0.8 Reverse primer 10 0.8 DNA 2 250 ng PCR 6.4 / 20 / 注1 ： PCR 注2 ： 8.4.2 PCR 反应 参数 PCR 2 表2 PCR 反 应参 数 95 5 min 1 98 10 s 30 50 60 30 s 72 1 min/kb 注： B 8.4.3 PCR 产 物电 泳分析 50 TAE 1 TAE 1.5% PCR 1.5% DNA 3 V/cm 5 V/cm 实时荧光 PCR 8.5.1 实时荧光 PCR 反应 体系 PC
9、R 3 No Template Control NTC DB44/T 2337 2021 6 表3 实时荧光 PCR 反 应体 系配 制表 L 2 Premix Ex Taq Mix 10 1 Forward Primer 0.4 0.2 mol/L 1 mol/L Reverse Primer 0.4 0.2 mol/L 1 mol/L Probe 0.8 Rox 50 0.2 / DNA 2 100 ng PCR 6.2 / 20 / 注1 ： Rox Rox PCR 注2 ： PCR 注3 ： 8.5.2 实时荧光 PCR 反应 参数 PCR 4 Ct 表4 实时荧 光PCR 反应 参数
10、 95 30 s 1 95 5 s 40 60 34 s 9 结果 普通PCR 9.1.1 质控标 准 A 9.1.2 结果判 定 9.1.2.1 9.1.2.2 实时荧 光PCR DB44/T 2337 2021 7 9.2.1 结果分 析和 条件 设定 9.2.2 质控标 准 9.2.2.1 Ct Ct 40 9.2.2.2 Ct Ct 40 9.2.2.3 Ct 35 PCR 9.2.3 结果判 定 9.2.3.1 9.2.3.2 Ct 35 9.2.3.3 Ct 35 40 PCR Ct 40 Ct 35 40 序列测 定 PCR 99% 10 防止交 叉污 染的 措施 GB/T 19
11、495.2 DB44/T 2337 2021 8 A A 附录A （规范 性） 溶液的 配制 A.1 0.02 mol/L pH7.2 磷酸 盐 缓冲液 （PBS）的 配制 A.1.1 A液 0.2 mol/L NaH2PO4 H2O 27.6 g 1 000 mL A.1.2 B液 0.2 mol/L NaH2PO4 7H2O 53.6 g Na2HPO4 12H2O 71.6 g Na2HPO4 2H2O 35.6 g 1 000 mL A.1.3 0.02 mol/LpH7.2 磷 酸盐 缓 冲液（PBS ）的 配制 A 14 mL B 36 mL NaCl 8.5 g 800 mL H
12、Cl pH 7.2 1 000 mL 121 15 min A.2 50TAE 电 泳缓 冲液 A.2.1 0.5 mol/L 乙二 铵四 乙酸 二 钠（EDTA ） 溶液 （pH8.0 ） EDTA-Na2 H2O 18.61 g 80 mL 5 mol/L pH 8.0 100 mL 121 15 min A.2.2 50 TAE 电 泳缓 冲液 配制 Tris 242 g 57.1 mL 0.5 mol/L EDTA pH8.0 l00 mL 1 000 mL 121 15 min l A.3 溴化乙 锭（EB） 溶液 （10 g/L） 20 mg 20 mL A.4 含0.5 g/mL
13、 溴化 乙锭 的1.5%琼 脂糖 凝胶 的配 制 1.5 g 1 TAE l00 mL DB44/T 2337 2021 9 , 50 55 EB 3 mm 5 mm DB44/T 2337 2021 10 B B 附录B （规范 性） 引物及 探针 序列 16sRNA PCR PCR B.1 PCR B.2 表B.1 普通 PCR 引物 5 3 bp Mycoplasma pulmonis Mpul-F AGCGTTTGCTTCACTTTGAA 266 55 Mpul-R GGGCATTTCCTCCCTAAGCT Helicobacter genus H-F CTATGACGGGTATCCG
14、GC 780 55 H-R CTCACGACACGAGCTGAC Helicobacter hepaticus Hh-F ATGGGTAAGAAAATAGCAAAAAGATTGCAA 705 55 Hh-R CTATTTCATATCCATAAGCTCTTGAGAATC Helicobacter bilis Hb-F ATGGAACAGATAAAGATTTTAAAGCAACTTCAG 435 55 Hb-R CTATGCAAGTTGTGCGTTAAGCAT Helicobacter rodentium Hr-F TTGTGAAATGGAGCAAATCTTAAAAACT 191 55 Hr-R T
15、AGCCAGTTTGGCATTCC (Helicobacter muridarum) Hm-F ATGACAAAAAAATATTCTTTCACAAAACTATTCATTGGT 807 55 Hm-R TTTATTTTAGATTCCATTTAACTGCTAAATCATCAATAGT Helicobacter typhlonius Ht-F AGGGACTCTTAAATATGCTCCTAGAGT 122 55 Ht-R ATTCATCGTGTTTGAATGCGTCAA Pasteurella genus PastF ATGGGAGTGGGTTGTACCA 165170 58 PastR CAATC
16、TGTGTGRACACTTRC Heyl Pasteurella. pneumotropica Hey1 PastF ATGGGAGTGGGTTGTACCA 326 58 HeylR TTGCAGATACTTGCCCTTAC Jawetz Pasteurella pneumotropica Jawetz PastF ATGGGAGTGGGTTGTACCA 451 58 JawR GGCATCCTAAAATACCCATCC DB44/T 2337 2021 11 表B.1 普通 PCR 引物 5 3 bp Actinobacillus muris A.m F AAGCGGTCGGTTTTAGCT
17、GT 255 58 A.m-R AAGCAGTTGGTT TTGGCTGT Streptococcus pneumoniae SP-F GGCTTAGAGGCTGTTCGT 701 58 SP-R ATCTCACCGTCTGTATAGA Corynebacterium bovis CB-F GGTGTGGGGATCTTCCACGAT 223 55 CB-R ACCACCTGTGAACAAGCCCA Salmonella typhimurium ST-F TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC 331 58 ST-R GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT Staph
18、ylococcus aureus Sau-F GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG 247 58 Sau-R TTAACCGTATCACCATCAATCG Corynebacterium kutscheri CK-F GCAACGCGAAGAACCTTACC 200 58 CK-R CCCGGCAGTCTCTCATGAGT Pseudomonas aeruginosa Pseu-F GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC 397 60 Pseu-R CGCTGGCCCATTCGCTCCAGCGCT Klebsiella pneumoniae KP-F TGGCCCGCGCC
19、CAGGGTTCGAAA 368 55 KP-R GATGTCGTCATCGTTGATGCCCAG O157 H7 Escherichia coli O157:H7 O157-F ATTGCGCTGAAGCCTTTG 499 55 O157-R CGAGTACATTGGCATCGTG Bordetella pseudohinzii Hinz-F CGTTCCGGTTGCCCAGAAG 318 62 Hinz-R GCCTTCGGCGGTCTTGTTGGTC Bordetella bronchiseptica Fla-F AGGCTCCCAAGAGAGAAAGGCTT 237 58 Fla-R
20、TGGCGCCTGCCCTATC Shigella spp. ipaH-F CCTTGACCGCCTTTCCGATAC 611 58 ipaH-R CAGCCACCCTCTGAGAGTACT DB44/T 2337 2021 12 表B.1 普通 PCR 引物 5 3 bp Tyzzer organism TY-F GTGCTAGGTGTTGGGAAG 196 55 TY-R TACTTTACGTAGCCTGTCAA Mycoplasma gallisepticum MG-F AATGATGCGACTAAACCAA 408 55 MG-R TCCACCCACATACCCAA Mycoplasm
21、a Synoviae MS-F CGGTGATAACCCAACAGA 688 55 MS-R ACCCCTCCTTAATACGCT 注： Y T/C R A/G 表B.2 实时荧 光PCR 扩 增引 物和 探针 5 3 Mycoplasma pulmonis Forward primer GGAAATGCCCTAAGTATGACGG Reverse primer CGGATAACGCTTGCACCCTA Probe FAM-CCTTGTCAGAAAGCACCGGCTAACTATGTG -BHQ-1 Helicobacter hepaticus Forward primer GGCAATATTA
22、ACTTTGATATGG Reverse primer TTGGCATTAAACCCTTTG Probe FAM TGCTACTCCTGATATGATGGCTCTTG-BHQ-1 Helicobacter bilis Forward primer TACCACTGGAATGTAAAAGGCA Reverse primer CTTCTTTTAGCGTTACATACGGAGT Probe FAM CCACAAGTCCATGCGGCAACAGAAG-BHQ-1 Helicobacter muridarum Forward primer GAGATGATGTTAGGGAGGGGCTTGT Revers
23、e primer CCTCTTACAAATGAGTTGCCCA Probe FAM-GGAACCACAGTTTGAGGGGCAGAC-BHQ-1 Helicobacter rodentium Forward primer TTGTGAAATGGAGCAAATCTCAAAAAC Reverse primer TAGCCAGTTTGGCATTCC Probe FAM-TTGTACTCACCGCCCGTCACACCAT-BHQ-1 Helicobacter typhlonius Forward primer GAGAGAAGATTATGACGGTATC Reverse primer CAGGATTTCACATCTGACTTAC Probe FAM-CTAACTCCGTGCCAGCAGCC-BHQ-1 注： FAM VIC BHQ1 MGB DB44/T 2337 2021 13 参考文 献 1 GB/T 14926 2 T/CALAS 20-2017 3 T/CALAS 24-2017 PCR 4 T/CALAS 40-2017 PCR 5 T/CALAS 43-2017 DB44/T 2337 2021 14 PCR DB44/T 2337 2021 * 563 1304 510220 020-84250337 DB44/T 2337 2021
