1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广东 省 地方标准 DB44/T 2336 2021 实验动物 病毒PCR 定性分析 Laboratory animal Qualitative analysis of virus with polymerase chain reaction method 2021 - 10 - 18 发布 2022 - 01 - 18 实施 广东省市 场监督 管 理局 发 布 DB44/T 2336 2021 I 目 次 . II 1 . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 2 5 . 2 6 . 2 7 . 3 8 . 3 9 . 10 10 . 11
2、 A . 12 B . 14 . 18 DB44/T 2336 2021 II 前 言 GB/T 1.1 2020 1 GD/TC 93 DB44/T 2336 2021 1 实 验动物 病毒PCR 定性分析 1 范围 PCR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB 19489 GB/T 19495.2 3 术语和 定义 聚合酶 链式 反应 polymerase chain reaction ，PCR DNA DNA DNA DNA DNA dNTP 逆转录-聚 合酶 链式 反应 reverse transcription-polymerase chain reaction ，RT-
3、PCR RNA Oligo dT RNA cDNA cDNA PCR 巢式PCR nested polymerase chain reaction PCR PCR DNA PCR PCR PCR PCR DNA 实时荧 光聚 合酶 链式 反应 real-time PCR ，实 时荧 光 PCR PCR PCR PCR PCR DB44/T 2336 2021 2 实时荧 光逆 转录-聚 合酶 链 式反应 real-time RT-PCR ， 实 时荧 光RT-PCR RT-PCR RT-PCR PCR PCR Ct 值 cycle threshold PCR 4 缩略语 cDNA DNA co
4、mplementary DNA CPE cytopathic effect DEPC diethyl pyrocarbonate DNA deoxyribonucleic acid EDTA ethylenediamine tetraacetic acid PBS phosphate buffered saline RNA ribonucleic acid TAE - - tris-acetate EDTA 5 原理 RNA / DNA PCR PCR PCR 6 主要设 备和 材料 PCR PCR PCR -20 -80 DB44/T 2336 2021 3 1.5 mL 2 mL 5 mL
5、 15 mL 1 mL PCR 0.2 mL 96 7 试剂 GB/T 6682 DNA RNA PBS A PCR DEPC DNA RNA A RNA TRIzol DNA DNA DNeasy Blood & Tissue Kit 注： DNA Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit DNA 75% DNA RNA 75% PCR Premix Taq TM Version 2.0 plus dye Premix Ex Taq Probe qPCR One Step Primerscript TM RT-PCR Kit Perfect Realtime 注： P
6、CR Takara PCR DNA 100 bp 2000 bp 50 TAE A 10 mg/mL A 1.5% A B B B.1 B.2 DNA RNA -20 8 方法 生物安 全措 施 GB 19489 采样及 样本 的处 理 8.2.1 脏器组 织 DB44/T 2336 2021 4 0.5 g 2 g 5 PBS 1 min 2 min 4 8 000 g 10 min 5 mL 8.2.2 盲肠内 容物 或粪 便 1 g 2.0 g 5 mL 5 PBS 1 min 2 min 8 000 g 5 min 5 mL 8.2.3 血液样 本 0.2 mL 0.5 mL EDTA
7、 3 5 8.2.4 拭子取 样 3 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5 min 5 mL 8.2.5 细胞培 养物 CPE 15 mL 1 500 g 5 min 1 mL PBS 1.5 mL CPE 8 000 g 5 min 15 mL 8.2.6 饲料、 垫料 和饮 水 5 g 10 g 50 mL 3 PBS 5 min 10 min 15 mL 4 8 000 g 5 min 5 mL 1.5 mL 8.2.7 设施设 备 5 cm 2 15 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5 min 5 mL 8.2.8 样本的 存放 2
8、 8 24 h -80 8.2.9 采样废 弃物 处理 DB44/T 2336 2021 5 核酸提 取 8.3.1 样本RNA 提 取 8.3.1.1 200 L 1 mL TRIzol 10 min 8.3.1.2 15 s RNA 5 min 4 10 000 g 15 min 8.3.1.3 - RNA TRIzol 60% 8.3.1.4 10 min 4 10 000 g 10 min RNA 8.3.1.5 1 mL75% 4 5 000 g 5 min 8.3.1.6 5 min 10 min RNA 100 DNA RNA RNA 8.3.1.7 RNA RNA 8.3.1.
9、8 RNA RT-PCR PCR -80 8.3.2 样本DNA 提 取 8.3.2.1 50 L 100 L 1.5 mL 2 mL 20 L K PBS 220 L 8.3.2.2 AL 56 10 min 8.3.2.3 8.3.2.4 8.3.2.3 2 mL 6 000 g 1 min / 8.3.2.5 2 mL AW1 6 000 g 1 min / 8.3.2.6 2 mL AW2 20 000 g 3 min / 8.3.2.7 1.5 mL AE 1 min 6 000 g 1 min DNA 8.3.2.8 DNA DNA 8.3.2.9 DNA PCR PCR -20
10、注： DNA DNA DNeasy Blood & Tissue Kit DNA PCR 方法 8.4.1 普通PCR DB44/T 2336 2021 6 8.4.1.1 PCR 反 应体 系 PCR 1 No Template Control NTC 表1 PCR 反 应体 系配 制表 L 2 Premix Taq Mix plus dye 10 1 Forward primer 10 0.8 Reverse primer 10 0.8 DNA 2 250 ng PCR 6.4 20 注1 ： PCR 注2 ： 8.4.1.2 PCR 反 应参 数 PCR 2 表2 PCR 反 应参 数
11、95 3 min 1 98 10 s 30 50 60 30 s 72 1 min/kb 注： B 8.4.2 RT-PCR 8.4.2.1 RT-PCR 反 应体 系 RT-PCR 3 No Template Control NTC DB44/T 2336 2021 7 表3 RT-PCR 反 应体 系配 制表 L 2 1 Step Buffer 10 1 PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.8 Forward primer 10 0.8 Reverse primer 10 0.8 RNA 2 PCR 5.6 20 注1 ： RT-PCR 注2 ： 8.4.2.2
12、 RT-PCR 反应 参数 RT-PCR 4 表4 RT-PCR 反 应参 数 50 30 min 1 94 2 min 1 94 30 s 30 55 65 30 s 72 1 min/kb 72 10 min 1 注： B 8.4.3 巢式PCR 8.4.3.1 巢式PCR 反 应体 系 PCR PCR 5 No Template Control NTC DB44/T 2336 2021 8 表5 巢式 PCR 反 应体 系配制 表 L PCR 2 Premix Taq Mix PCR Forward primer 1 Reverse primer 1 cDNA /DNA 10 6.4 0
13、.8 0.8 2 20 1 PCR 2 Premix Taq Mix Loading dye mix PCR Forward primer 2 Reverse primer 2 PCR 10 7.5 0.8 0.8 1 20 1 注1 ： RT-PCR 注2 ： 8.4.3.2 巢式PCR 反 应参 数 PCR 6 表6 巢式 PCR 反 应参 数 PCR 94 3 min 1 98 10 s 20 50 60 30 s 72 1 min/kb PCR 94 3 min 1 95 30 s 30 50 60 30 s 72 1 min/kb 注： B 8.4.4 PCR 产物 电 泳分 析 5
14、0 TAE 1 TAE 1.5% PCR PCR 1.5% DNA 3 V/cm 5 V/cm DB44/T 2336 2021 9 实时荧 光PCR 方法 8.5.1 实时荧 光PCR 8.5.1.1 实时荧光 PCR 反 应体 系 PCR 7 No Template Control NTC 表7 实时荧光 PCR 反 应体 系配 制表 L 2 Premix Ex Taq Mix 10 1 Forward Primer 10 0.4 0.2 mol/L 1 mol/L Reverse Primer 10 0.4 0.2 mol/L 1 mol/L Probe 10 0.8 Rox 50 0.
15、2 / DNA 2 100 ng PCR 6.2 / 20 / 注1 ： Rox Rox PCR 注2 ： PCR 注3 ： 8.5.1.2 实时荧 光PCR 反 应参 数 PCR 8 Ct 表8 实时荧 光PCR 反 应参 数 95 30 s 1 95 5 s 40 60 34 s 8.5.2 实时荧 光 RT-PCR 8.5.2.1 实时荧 光 RT-PCR 反应 体系 RT-PCR 9 No Template Control NTC DB44/T 2336 2021 10 表9 实时荧 光 RT-PCR 反 应体 系 配制表 L 2 One Step RT-PCR Buffer III
16、10 1 PrimeScriptRT Enzyme Mix II 0.4 / Ex TaqHS 0.4 / Forward Primer 10 0.4 Reverse Primer 10 0.4 Probe 10 0.8 Rox 50 0.4 / RNA 2 10 pg 100 ng PCR 5.2 / 20 / 注1 ： RT-PCR 注2 ： Rox Rox PCR 注3 ： 8.5.2.2 实时荧 光 RT-PCR 反应 参数 RT-PCR 10 Ct 表10 实时荧 光 RT-PCR 反 应参 数 42 5 min 1 95 10 s 1 95 5 s 40 60 34 s 9 结果
17、普通PCR/ 普通RT-PCR/巢式 PCR 9.1.1 质控标 准 B DB44/T 2336 2021 11 9.1.2 结果判 定 9.1.2.1 9.1.2.2 实时荧光 PCR/ 实时 荧光 RT-PCR 9.2.1 结果分 析和 条件 设定 9.2.2 质控标 准 9.2.2.1 Ct Ct 40 9.2.2.2 Ct Ct 40 9.2.2.3 Ct 35 PCR 9.2.3 结果判 定 9.2.3.1 9.2.3.2 Ct 35 9.2.3.3 Ct 35 40 PCR Ct 40 Ct 35 40 序列测 定 PCR 99% 10 防止交 叉污 染的 措施 GB/T 1949
18、5.2 DB44/T 2336 2021 12 A A 附录A （规范 性） 溶液的 配制 A.1 0.02 mol/L pH7.2 磷酸 盐 缓冲液 （PBS ） 的配 制 A.1.1 A液 0.2 mol/L NaH2PO4 H20 27.6 g 1 000 mL A.1.2 B液 0.2 mol/L NaH2PO4 7H2O 53.6 g Na2HPO4 12H2O 71.6 g Na2HPO4 2H2O 35.6 g 1 000 mL A.1.3 0.02 mol/L pH7.2 磷 酸盐 缓冲液 （PBS ） 的配 制 A 14 mL B 36 mL NaCl 8.5 g 800 m
19、L HCl pH 7.2 1 000 mL 121 15 min A.2 无RNase 去 离子 水的 配制 0.1% DEPC 121 15 min A.3 50TAE 电 泳缓 冲液 A.3.1 0.5 mol/L 乙二 铵四 乙酸 二 钠（EDTA ） 溶液 （pH 8.0 ） EDTA-Na2-H2O 18.61 g 80 mL 5 mol/L pH 8.0 100 mL 121 15 min A.3.2 50TAE 电 泳缓 冲液 配制 Tris 242 g 57.1 mL 0.5 mol/L EDTA pH8.0 l00 mL 1000 mL 121 15 min lX A.4 溴
20、化乙 锭（EB） 溶液 （10 g/L） 20 mg 20 mL A.5 含0.5 g/mL 溴化 乙锭 的1.5%琼 脂糖 凝胶 的配 制 1.5 g DB44/T 2336 2021 13 1 TAE l00 mL , 50 55 EB 5 L 3 mm 5 mm DB44/T 2336 2021 14 B B 附录B （规范 性） 引物及 探针 序列 PCR PCR PCR B.1 PCR B.2 表B.1 实验动 物病 毒普 通PCR/ 普通 RT-PCR 引物 5 3 bp LCMV Forward primer CGCACCGGGGATCCTAGGCT 712 55 Reverse
21、 primer CCTGTCCAGCCCCAGCCAC HV Forward primer AAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG 464 55 Reverse primer GTACAICCTGTRCCIACCCC HTN Forward primer GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC 383 55 Reverse primer GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC SEO Forward primer GTGGACTCTTCTTCTCATTATT 418 55 Reverse primer TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG E
22、CT Forward primer TGACTGAATACGACGAC 338 55 Reverse primer TGGATCTAATTGCGCATG / MHV/RCV Forward primer AATGGAACTTCTCGTTGGG 375 55 Reverse primer TAGTGGCTGTTAGTGTATGG SV Forward primer ATGAAGGACAAAGCATTATCGCCTA 180 55 Reverse primer CAACCAGTCTCCTGATTCCACGTA PVM Forward primer AGATCACAGAGCCCGTCAAAAT 12
23、2 60 Reverse primer GCATATAACATCCAATACGAGTTTGAA III REO3 Forward primer TGCAAAGATGGGGAACGC 411 55 Reverse primer TGGTGACACTGACAGCAC MVM MVM Forward primer GAGCGCCATCTAGTGAGC 483 55 Reverse primer ATTTGCCTGTGCTGGCTG MPV MPV Forward primer GCAGCAATGATGTAACTGAAGCT 260 55 Reverse primer CCATCTGCCTGAATCA
24、TAGCTAA TMEV Forward primer CCTATTTGCACAGCCGT 403 55 Reverse primer GGAGAGGTGCCATAGTAGC MAD Forward primer TWCATGCACATCGCBGG 281 55 Reverse primer CCGCGGATGTCAAA DB44/T 2336 2021 15 表B.1 实 验动 物病 毒普 通PCR/普通 RT-PCR 引物 5 3 bp POLY Forward primer ATGTGCACAGCGTGTA 369 55 Reverse primer TGTCATCGGGCTCAGC M
25、NV Forward primer CAGATCACATGCTTCCCAC 187 60 Reverse primer AGACCACAAAAGACTCATCAC H-1 H1 Forward primer CTAGCAACTCTGCTGAAGGAACTC 253 55 Reverse primer TAGTGATGCTGTTGCTGTATCTGATG KRV KRV Forward primer GCACAGACAACCAAACAGGAACTCTCC 280 55 Reverse primer AGTCTCACTTTGAGCGGCTG RMV RMV Forward primer ACTGA
26、GAACTGGAGACGAATTC 843 55 Reverse primer GGTCTCAGTTTGGCTTTAAGTG RPV RPV Forward primer CGCACATGTAGAATTTTTGCTG 487 55 Reverse primer CAAAGTCACCAGGCAATGTGTT RTV Forward primer GACCTCTTTCAACGCGACG 363 55 Reverse primer CGATGTCTGTTCTAAGTTTCC RHDV Forward primer ATGCCAATGCTGGGTCTG 368 59 Reverse primer TT
27、GAGGCGTGTATGTGATGG RRV Forward primer ATGGTTCGCTTGTGTCTTAGTTG 251 60 Reverse primer ATGCGTTGGGTGTAGTTCCTGTA D SRV-D Forward primer 1 GAATCTGTAGCGGACAATTGGCTT 461 55 Reverse primer 1 GGGCGGATTGCTGCCTGACA Forward primer 2 ACTTGTTAGGGCAGTCCTCTCAGG 400 55 Reverse primer 2 ACAGGCTGGATTAGCGTTTTCATA SIV Fo
28、rward primer 1 TGTCAAAAAATACTTTCGGTCTTAG 796 55 Reverse primer 1 TGTTTGAGTCATCCAATTCTTTACT Forward primer 2 TAAATGCCTGGGTAAAAT 313 55 Reverse primer 2 TGGTATGGGGTTCTGTTGTCTGT T I STLV-1 Forward primer GTGCCAATCATGGACCTGCC 160 60 Reverse primer TCCTGGAGCGTCGATTAGAAGG 注1 ： Y T/C R A/G W A/T B T/C/G 注2
29、 ： D PCR PCR DB44/T 2336 2021 16 表B.2 实验动 物病 毒 实 时荧 光PCR/ 实时 荧 光 RT-PCR 扩增 引 物和探 针 5 3 LCMV Forward primer AAGCTCTGGACTGGAGCCAA Reverse primer GAGAGCGGAGGTTAAGTTGCA Probe FAM-TTTCACCAACGACTCCATCCTTAATCACAACT-BHQ-1 HTN Forward primer CAATCAYATTTRCACTATTATTATCAGG Reverse primer TTAACTGACCCACCCKYTGARTA
30、AT Probe FAM-TTCCCACCCATAAATG-MGB SEO Forward primer GGTGATGAYATGGAYCCAGA Reverse primer TTCATAGGTTCCTGGTTHGAGA Probe VIC-CTTCGTAGCCTGGCTCA-MGB ECT Forward primer ATCCGGATACTACTGCGAATTTG Reverse primer CCGTAACCAGAACCACACTTTG Probe FAM-CAAACGGTTGCAGGCTATGTGTACCACAA-BHQ-1 / MHV/RCV Forward primer GGAA
31、CTTCTCGTTGGGCATTATACT Reverse primer ACCACAAGATTATCATTTTCACAACATA Probe FAM -ACATGCTACGGCTCGTGTAACCGAACTGT-BHQ-1 SV Forward primer GGGCGGCATCTGTAGAAATC Reverse primer CGGAAATCACGAGGGATGG- Probe FAM AGGCGTCGATGCGGTGTTCCAAC-BHQ-1 PVM Forward primer GCAAGGACACTCGGCATGT Reverse primer TGGAGCCCTATTTCTGCC
32、AC Probe FAM-CTTACTTACTGCCTTCAACCGTTGCGAAGA-BHQ1 MVM MVM Forward primer GCCATACACACCTGCAGCAAA Reverse primer TGGYGATGCTATGGTTGGT Probe FAM-TCAATGGAAACACTTGGTTTCTACCCTTGGA-BHQ-1 MPV MPV Forward primer TGGTTGCTCTKGAYTCTAACAACATA Reverse primer TTAAAGTAGTACCTGTAAGGACTTGG Probe FAM-CCTTACACACCAGCAACAGAC
33、AACCAAGA-BHQ-1 TMEV Forward primer CTTGTTGAAGTGTTTCCCTCC Reverse primer GGGAGGCATGATGGTAGTTT Probe FAM-TCGCGACGTGGTTGGAGATCTAA-BHQ-1 MAD Forward primer ACTCTGAGCGGTGTCCGC Reverse primer GATGTGCATGAAGGCCCACT Probe FAM-TGACGACGCCTTCAATGCAGCC-BHQ1 DB44/T 2336 2021 17 表B.2 实 验动 物病 毒 实 时 荧光PCR/ 实时 荧光 RT-
34、PCR 扩增 引物 和探 针 5 3 POLY Forward primer CGGCGTCTCTAAATGCGAG Reverse primer AGCAGTTTGGGAACGGGTG Probe FAM - CAAAATGTACAAAGGCCTGTCCAAGACCC -BHQ1 MNV Forward primer TCTGTYCTGCGCTGGGTGC Reverse primer GCTGCGCCATCACTCATCC Probe FAM- ATGCTGAGACCCCGCAGGAACG -BHQ-1 RTV Forward primer CCAAGCGTGTGTCCTATTTGC Re
35、verse primer TCCATAGTAAGAAGATCCGCTGG Probe FAM-CAGCCATTGACAAAAGTTCCGACGGAAT-BHQ1 D SRV-D Forward primer CTGGWCAGCCAATGACGGG Reverse primer CGCCTGTCTTAGGTTGGAGTG Probe FAM-TCACTAACCTAAGACAGGAGGGTCGTCA-BHQ1 FAM-TCCTAAACCTAAGACAGGAGGGCTGTCA-BHQ1 SIV Forward primer GGAAACAGGAACAGCAGAAACTAT Reverse prime
36、r ACCACCTATTTGTTGTACTGGGTA Probe FAM-CCTCCTCTGCCGCTAGATGGTGCT-BHQ1 T I STLV-1 Forward primer 示例1 ：CCTCCTACATGAGGTGGACA Reverse primer ATCAAGGCCTCGTCTGTTCT Probe 示例2 ：FAM- ACTCAAAATTGCGCAATATGCTGCC -BHQ-1 AIV Forward primer GACCRATCCTGTCACCTCTGAC Reverse primer AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA Probe FAM-TGCA
37、GTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1 CAV Forward primer CTGGTTTCAAGAATGTGC Reverse primer TGGGAGTAGTGGTAATCA Probe FAM-ATCAACCCAAGCCTCCCTCG-BHQ 注1 ： Y T/C R A/G K T/G H A/T/C 注2 ： FAM VIC BHQ1 MGB DB44/T 2336 2021 18 参考文 献 1 GB/T 14926.21-2008 2 T/CALAS 22-2017 3 T/CALAS 25-2017 PCR 4 T/CALAS 26-2017 PCR 5 T/C
38、ALAS 27-2017 MPV PCR 6 T/CALAS 28-2017 MVM PCR 7 T/CALAS 39-2017 PCR 8 T/CALAS 41-2017 9 T/CALAS 42-2017 RMV RPV 10 T/CALAS 44-2017 PCR 11 T/CALAS 45-2017 PCR 12 T/CALAS 46-2017 PCR 13 T/CALAS 47-2017 PCR 14 T/CALAS 48-2017 D PCR 15 T/CALAS 49-2017 PCR 16 T/CALAS 50-2017 III PCR DB44/T 2336 2021 19 PCR DB44/T 2336 2021 * 563 1304 510220 020-84250337 DB44/T 2336 2021
