1、I C S 6 5 . 0 2 0 . 4 0 C C S B 6 1 44 广 东 省 地 方 标 准 D B 4 4 / T 2 3 4 6 2 0 2 1 木 麻 黄 青 枯 菌 强 致 病 性 菌 株 筛 选 技 术 规 程 T e c h n i c a l r e g u l a t i o n s o n s c r e e n i n g s t r a i n s o f R a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m w i t h h i g h p a t h o g e n i c i t y t o C a s u a r i n
2、 a s p p . 2 0 2 1 - 1 2 - 0 7 发 布 2 0 2 2 - 0 3 - 0 7 实 施 广 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 4 4 / T 2 3 4 6 2 0 2 1 I 目 次 前 言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I I 1 范 围 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 规 范 性 引 用 文 件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 术 语 和 定 义 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 原 理 与 方 法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 仪 器 用 具 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
8、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6 培 养 基 与 试 剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
9、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 7 病 菌 分 离 与 纯 化 . . . . . . . . . . . .
10、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 8 检 测 鉴 定 . . . . . . . . . . . . .
11、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 9 菌 株 鉴 定 . .
12、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13、. . . 5 1 0 强 致 病 性 菌 株 筛 选 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14、. 5 1 1 菌 种 保 存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15、. . . . . . . . . . . 5 附 录 A （ 资 料 性 ） 木 麻 黄 青 枯 菌 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 附 录 B （ 规
16、范 性 ） 培 养 基 及 试 验 方 法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 附 录 C （ 规 范 性 ） 试 验 调 查 表 格 . . . . . . . . . . . . . .
17、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1D B 4 4 / T 2 3 4 6 2 0 2 1 I I 前 言 本 文 件 按 照 G B / T 1 . 1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标
18、 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起 草 。 本 文 件 由 广 东 省 林 业 局 提 出 、 归 口 ， 并 组 织 实 施 。 本 文 件 起 草 单 位 ： 广 东 省 林 业 科 学 研 究 院 。 本 文 件 主 要 起 草 人 ： 许 秀 玉 、 黎 明 、 余 玉 娟 、 徐 斌 、 甘 先 华 、 王 明 怀 、 张 应 中 、 张 卫 强 。D B 4 4 / T 2 3 4 6 2 0 2 1 1 木 麻 黄 青 枯 菌 强 致 病 性 菌 株 筛 选 技 术 规 程 1 范 围 本 文 件 规 定 了 木 麻 黄 青 枯 菌 （ R a l
19、s t o n i a s o l a n a c e a r u m ） 分 离 与 纯 化 、 检 测 鉴 定 方 法 、 菌 株 鉴 定 、 强 致 病 性 菌 株 筛 选 及 菌 种 保 存 等 技 术 要 求 。 本 文 件 适 用 于 木 麻 黄 属 植 物 强 致 病 性 青 枯 菌 菌 株 的 筛 选 。 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不
20、注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 G B 4 7 8 9 . 2 8 - 2 0 1 3 食 品 微 生 物 学 检 验 培 养 基 和 试 剂 的 质 量 要 求 3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。 青 枯 菌 R a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m 病 害 英 文 名 ： B a c t e r i a l w i l t o f C a s u a r i n a ； 属 细 菌 界 B a c t e r i
21、a ， 变 形 菌 门 P r o t e o b a c t e r i a ， - 变 形 菌 纲 B e t a p r o t e o b a c t e r i a ， 伯 克 氏 菌 目 B u r k h o l d e r i a l e s ， 伯 克 氏 菌 科 B u r k h o l d e r i a c e a e ， 青 枯 菌 属 R a l s t o n i a 。 病 原 菌 通 过 根 部 从 病 株 蔓 延 至 健 株 ， 通 过 土 壤 、 水 流 进 行 远 距 离 传 播 。 木 麻 黄 青 枯 菌 的 其 他 信 息 参 见 附 录 A 。
22、强 致 病 性 S t r o n g p a t h o g e n i c a b i l i t y 能 让 木 麻 黄 植 株 迅 速 感 病 死 亡 的 能 力 。 褐 梗 小 枝 B r o w n l i g n i f i e d t w i g s 基 径 2 m m 5 m m 的 褐 色 木 质 化 小 枝 ， 具 多 分 枝 。 分 枝 B r a n c h 生 长 在 小 枝 上 的 绿 色 枝 条 。 小 苗 s e e d l i n g 无 性 系 苗 或 实 生 苗 ， 5 0 c m 7 0 c m 高 。 4 原 理 与 方 法D B 4 4 / T 2
23、 3 4 6 2 0 2 1 2 青 枯 病 菌 菌 株 间 存 在 着 显 著 的 致 病 性 差 异 ， 且 在 木 麻 黄 青 枯 菌 的 病 理 系 统 中 ， 木 麻 黄 同 时 存 在 水 平 抗 性 与 垂 直 抗 性 ， 利 用 不 同 接 种 方 法 、 不 同 抗 性 植 物 材 料 与 多 菌 株 交 互 接 种 测 定 的 方 法 ， 才 能 准 确 筛 选 出 强 致 病 性 菌 株 。 5 仪 器 用 具 仪 器 植 物 生 长 培 养 箱 、 恒 温 培 养 箱 、 恒 温 振 荡 培 养 箱 、 电 子 天 平 （ 精 度 0 . 0 0 0 1 g ） 、 生
24、 物 显 微 镜 （ 具 照 相 系 统 ） 、 超 净 工 作 台 、 高 压 灭 菌 锅 、 高 速 冷 冻 离 心 机 （ 1 2 0 0 0 r / m i n ） 、 P C R 仪 、 电 泳 仪 、 电 泳 槽 、 凝 胶 成 像 系 统 、 离 心 机 、 恒 温 水 浴 锅 （ 3 0 9 5 ） 、 低 温 冰 箱 、 纯 水 机 、 涡 旋 振 荡 器 、 分 光 光 度 计 、 可 调 微 量 加 样 器 等 。 用 具 镊 子 、 手 术 剪 、 解 剖 刀 、 量 筒 、 烧 杯 、 培 养 皿 、 三 角 瓶 、 离 心 管 、 试 管 、 接 种 针 、 接 种
25、 环 等 。 6 培 养 基 与 试 剂 培 养 基 C P G 培 养 基 ： 按 附 录 B 中 的 B . 1 规 定 执 行 。 T T C 培 养 基 ： 按 附 录 B 中 的 B . 2 规 定 执 行 。 试 剂 革 兰 氏 染 色 试 剂 ： 按 附 录 B 中 的 B . 3 规 定 执 行 。 P C R 检 测 所 需 试 剂 ： 按 附 录 B 中 的 B . 4 规 定 执 行 。 2 , 3 , 5 - 三 苯 基 氯 化 四 氮 唑 （ T T C ） 7 病 菌 分 离 与 纯 化 病 株 判 断 小 枝 黄 化 ， 稀 疏 、 凋 落 ， 枯 枝 枯 梢 多
26、 ； 根 系 发 黑 腐 烂 ； 木 质 部 局 部 或 全 部 变 褐 色 至 黑 褐 色 ； 树 皮 常 纵 裂 成 溃 疡 状 ； 坏 死 根 茎 有 水 浸 臭 味 ； 根 、 主 茎 、 侧 枝 横 切 面 伤 口 有 乳 白 色 至 黄 褐 色 的 细 菌 脓 液 溢 出 。 样 本 采 集 挖 出 病 根 ， 剪 取 直 径 0 . 5 c m 1 . 5 c m 、 木 质 部 呈 水 渍 状 或 半 透 明 状 主 根 或 侧 根 2 段 3 段 ， 每 段 1 0 c m 2 0 c m ， 封 口 袋 封 装 ， 记 录 采 集 时 间 、 地 点 ， 带 回 实 验 室
27、 分 离 病 菌 。 病 菌 分 离 7 . 3 . 1 稀 释 分 离 法D B 4 4 / T 2 3 4 6 2 0 2 1 3 取 病 根 （ 约 3 c m ） ， 自 来 水 洗 净 ， 7 5 的 酒 精 浸 泡 消 毒 3 0 s ， 置 无 菌 水 冲 洗 3 次 ， 每 次 3 0 s ， 在 超 净 工 作 台 上 剥 去 外 皮 ， 置 于 无 菌 培 养 皿 中 切 除 两 端 ， 最 后 将 其 横 切 成 3 份 5 份 ， 放 入 含 有 5 m l 1 0 m l 无 菌 水 的 培 养 皿 内 3 0 m i n ， 搅 拌 形 成 病 菌 悬 浮 液 。
28、用 接 种 环 蘸 取 菌 液 在 T T C 培 养 基 平 板 上 划 线 分 离 ， 至 少 3 个 平 板 ， 编 号 ， 于 3 0 下 恒 温 培 养 2 4 h 4 8 h 。 7 . 3 . 2 根 系 溢 出 法 将 8 c m 1 0 c m 长 的 病 根 洗 净 ， 两 端 切 成 平 整 的 新 鲜 断 面 ， 把 其 中 一 端 浸 泡 于 装 有 无 菌 水 中 的 玻 璃 瓶 中 ， 室 温 放 置 1 2 h 3 6 h 后 ， 在 病 根 的 另 一 端 断 面 会 流 出 乳 白 色 的 菌 脓 。 用 接 种 针 挑 取 菌 脓 划 线 培 养 于 T
29、T C 培 养 基 平 板 上 ， 至 少 3 个 平 板 ， 编 号 ， 置 于 3 0 下 恒 温 培 养 2 4 h 4 8 h 。 病 菌 纯 化 在 培 养 皿 内 挑 取 不 规 则 圆 形 ， 乳 白 色 、 中 心 部 位 粉 红 色 ， 具 有 流 动 性 的 单 菌 落 ， 接 种 于 T T C 培 养 基 平 板 上 ， 3 0 条 件 下 扩 大 培 养 3 6 h 4 8 h ， 每 个 菌 落 接 种 3 个 培 养 皿 并 编 号 。 病 菌 培 养 7 . 5 . 1 固 体 培 养 接 种 于 T T C 或 C P G 固 体 培 养 基 中 ， 3 0
30、条 件 下 培 养 2 4 h 4 8 h 。 7 . 5 . 2 液 体 悬 浮 培 养 将 分 离 纯 化 后 的 青 枯 病 菌 接 种 于 三 角 瓶 中 ， C P G 液 体 培 养 基 振 荡 培 养 ， 液 体 培 养 基 体 积 不 超 过 三 角 瓶 容 积 的 1 / 2 ， 1 5 0 r / m i n 2 0 0 r / m i n ， 3 0 条 件 下 培 养 1 2 h 2 4 h 。 8 检 测 鉴 定 菌 落 特 征 在 T T C 固 体 培 养 基 平 板 上 菌 落 呈 不 规 则 圆 形 ， 略 隆 起 ， 白 色 或 乳 白 色 ， 中 心 部
31、位 淡 红 色 或 粉 红 色 （ 有 的 中 央 部 位 出 现 螺 旋 样 红 色 沉 着 ） ， 不 透 明 ， 具 有 流 动 性 。 形 态 特 征 青 枯 菌 菌 体 呈 短 杆 状 ， 两 端 钝 圆 ， 大 小 为 （ 1 . 5 m 2 . 5 m ） （ 0 . 5 m 0 . 7 m ） ， 多 数 无 鞭 毛 ， 少 数 具 1 根 3 根 极 生 鞭 毛 ， 无 芽 胞 ， 无 荚 膜 。 革 兰 氏 染 色 按 G B 4 7 8 9 . 2 8 - 2 0 1 3 中 的 方 法 进 行 革 兰 氏 染 色 反 应 。 若 革 兰 氏 染 色 呈 阴 性 ， 则
32、进 行 下 一 步 检 测 。 1 6 S r R N A 测 序 鉴 定 从 分 离 的 菌 株 中 提 取 D N A 作 为 模 板 ， P C R 扩 增 青 枯 菌 1 6 S r R N A 基 因 片 段 ， 以 无 菌 双 蒸 水 模 板 做 为 空 白 对 照 ， 用 已 知 青 枯 菌 菌 株 D N A 做 阳 性 对 照 ， 扩 增 目 的 片 段 大 小 约 为 2 8 0 b p 。 P C R 产 物 回 收 后 测 序 、 比 对 ， 具 体 检 测 方 法 步 骤 按 附 录 B 中 的 B . 4 规 定 执 行 。 L A M P 快 速 检 测D B 4
33、 4 / T 2 3 4 6 2 0 2 1 4 以 青 枯 菌 的 l p x C 基 因 序 列 作 为 检 测 靶 标 ， 设 计 4 条 L A M P 特 异 性 引 物 ， 其 中 F 3 （ 5 - C C T G T A C G T G G T C G G C T A T - 3 ） 和 B 3 （ 5 - A C C G C A A C A C G G G A T C A - 3 ） 为 外 侧 引 物 ， F I P （ 5 - T A C G C C G T T T C A T C G G C C A G G T A C A C G G C G C A C A A G T
34、 - 3 ） 和 B I P （ 5 - A T C G T C A C G T T C G A C A A G G T G G A A T G C C G G C T G C A A C T G - 3 ） 为 内 侧 引 物 。 L A M P 反 应 结 束 后 对 扩 增 产 物 进 行 检 测 ， 具 体 检 测 方 法 步 骤 按 附 录 B 中 的 B . 5 规 定 执 行 。 致 病 性 测 定 8 . 6 . 1 褐 梗 小 枝 水 培 接 种 8 . 6 . 1 . 1 材 料 选 择 对 青 枯 病 抗 性 具 有 差 异 的 木 麻 黄 无 性 系 ， 如 A 1 3
35、 与 K 1 8 （ 感 病 ） ， G 1 与 3 0 （ 抗 病 ） 等 。 8 . 6 . 1 . 2 方 法 恒 温 水 培 接 种 法 ， 具 体 操 作 方 法 按 附 录 B 中 的 B . 6 规 定 执 行 。 8 . 6 . 1 . 3 相 对 病 害 强 度 分 级 标 准 相 对 病 害 强 度 分 级 标 准 如 下 ： a ) 0 级 ： 分 枝 无 症 状 ， 级 数 值 为 0 ； b ) 1 级 ： 分 枝 萎 蔫 下 垂 ， 保 持 绿 色 ， 级 数 值 为 1 ； c ) 2 级 ： 分 枝 枯 黄 、 萎 蔫 下 垂 ， 级 数 值 为 2 ； d )
36、 3 级 ： 分 枝 干 枯 死 亡 ， 级 数 值 为 3 。 8 . 6 . 1 . 4 病 情 指 数 病 情 指 数 是 全 面 考 虑 发 病 率 与 严 重 度 的 综 合 指 标 。 病 情 指 数 按 式 （ 1 ） 计 算 。 楰 ( 1 ) 式 中 ： I D 病 情 指 数 ； N i 各 级 病 级 分 枝 数 ； G i 各 级 病 级 相 应 级 数 值 ； G k 最 高 级 数 值 ； N t 调 查 总 分 枝 数 。 8 . 6 . 2 小 苗 盆 栽 接 种 8 . 6 . 2 . 1 材 料 选 择 对 青 枯 病 抗 性 具 有 差 异 的 木 麻 黄
37、 无 性 系 ， 如 A 1 3 与 K 1 8 （ 感 病 ） ， G 1 与 3 0 （ 抗 病 ） 等 。 8 . 6 . 2 . 2 方 法 移 栽 浸 根 接 种 法 ， 具 体 操 作 方 法 按 附 录 B 中 的 B . 7 规 定 执 行 。 8 . 6 . 2 . 3 死 亡 率 计 算D B 4 4 / T 2 3 4 6 2 0 2 1 5 以 株 为 单 位 调 查 ， 记 录 无 病 植 株 与 死 亡 植 株 数 。 死 亡 率 按 式 （ 2 ） 计 算 。 楰 ( 1 ) 式 中 ： P 死 亡 率 ； D 死 亡 植 株 数 ， 单 位 为 株 ； N 调
38、查 总 株 数 ， 单 位 为 株 。 9 菌 株 鉴 定 分 离 纯 化 得 到 的 细 菌 菌 株 符 合 以 下 几 方 面 的 检 测 结 果 ， 则 可 以 判 定 为 青 枯 菌 菌 株 。 a ) 在 T T C 半 选 择 性 培 养 基 上 的 菌 落 特 征 与 描 述 相 符 。 b ) 革 兰 氏 染 色 反 应 呈 阴 性 。 c ) P C R 扩 增 产 物 测 序 结 果 与 已 知 的 R a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m 1 6 S r R N A 基 因 序 列 同 源 性 达 9 9 % 以 上 或 经 L
39、A M P 快 速 检 测 ， 反 应 结 束 后 反 应 管 中 反 应 液 呈 现 绿 色 。 1 0 强 致 病 性 菌 株 筛 选 符 合 以 下 两 个 方 面 的 检 测 结 果 ， 则 可 以 判 定 为 青 枯 菌 强 致 病 性 菌 株 。 a ) 褐 梗 小 枝 水 培 接 种 法 ， 参 试 植 物 材 料 的 病 情 指 数 均 在 7 0 以 上 。 b ) 小 苗 盆 栽 接 种 参 试 植 物 材 料 死 亡 率 均 在 7 0 % 以 上 。 1 1 菌 种 保 存 蒸 馏 水 保 存 法 将 分 离 纯 化 后 的 病 原 菌 放 入 盛 有 灭 菌 蒸 馏
40、水 的 试 管 中 ， 控 制 菌 的 浓 度 约 1 0 7 8 c f u / m l ， 加 塞 放 入 4 恒 温 冰 箱 中 临 时 保 存 ， 保 存 时 间 不 超 过 1 周 。 甘 油 液 保 存 法 将 纯 甘 油 配 制 成 5 0 % 的 水 溶 液 ， 高 压 灭 菌 后 置 于 - 2 0 冰 箱 待 用 。 保 存 菌 种 时 将 5 0 % 甘 油 与 菌 液 按 2 : 1 比 例 混 合 ， 剧 烈 震 荡 ， 充 分 混 匀 ， 置 - 2 0 至 - 8 0 可 保 存 3 年 左 右 。 液 氮 超 低 温 保 存 法 将 冰 浴 过 的 青 枯 菌
41、菌 悬 液 分 装 到 冷 冻 管 内 ， 套 上 热 收 缩 塑 料 管 ， 加 热 ， 并 使 之 完 全 密 封 。 将 密 封 好 的 冷 冻 管 快 速 在 液 氮 中 冷 冻 ， 再 将 冷 冻 过 的 冷 冻 管 放 入 液 氮 罐 的 格 子 内 保 存 ， 经 常 注 意 补 充 液 氮 ， 可 保 存 1 0 年 以 上 。 冷 冻 干 燥 保 存 法 在 培 养 皿 中 分 离 纯 化 好 菌 种 后 ， 加 入 高 压 灭 菌 过 的 保 护 剂 ， 用 接 种 环 将 菌 苔 轻 轻 刮 起 ， 制 成 菌 悬 液 。 将 菌 悬 液 分 装 于 安 瓿 管 中 ，
42、在 - 8 0 冰 箱 预 冻 1 h 2 h ， 再 将 冷 冻 后 的 样 品 安 瓿 管 置 于 冷 冻 干 燥 机 内 开 始 冷 冻 干 燥 8 h 2 0 h ， 可 保 存 1 0 年 以 上 。D B 4 4 / T 2 3 4 6 2 0 2 1 6 A A 附 录 A （ 资 料 性 ） 木 麻 黄 青 枯 菌 A . 1 地 理 分 布 亚 洲 、 欧 洲 、 非 洲 、 北 美 洲 、 南 美 洲 均 有 分 布 ； 我 国 主 要 分 布 于 福 建 、 广 东 、 广 西 、 海 南 、 浙 江 、 江 苏 、 湖 北 、 湖 南 、 江 西 、 云 南 、 贵 州
43、 、 四 川 、 重 庆 、 山 东 、 河 南 、 河 北 、 安 徽 、 北 京 、 天 津 、 上 海 、 台 湾 。 A . 2 寄 主 范 围 该 病 菌 可 侵 染 茄 科 、 豆 科 、 芭 蕉 科 等 5 4 个 科 的 4 5 0 余 种 植 物 ， 主 要 有 ： 木 麻 黄 、 桉 树 、 番 茄 、 马 铃 薯 、 茄 子 、 烟 草 、 香 蕉 、 海 里 康 、 桑 树 、 龙 葵 、 辣 椒 、 花 生 、 芝 麻 、 甘 薯 、 油 橄 榄 和 姜 等 。 A . 3 病 株 症 状 植 株 感 染 青 枯 菌 后 ， 小 枝 黄 化 ， 稀 疏 、 凋 落 ，
44、 枯 枝 枯 梢 多 ， 根 系 发 黑 腐 烂 ， 木 质 部 局 部 或 全 部 变 褐 色 至 黑 褐 色 ， 树 皮 常 纵 裂 成 溃 疡 状 ， 坏 死 根 茎 有 水 浸 臭 味 ， 根 、 主 茎 、 侧 枝 横 切 面 伤 口 有 乳 白 色 至 黄 褐 色 的 细 菌 脓 液 溢 出 。 A . 4 病 原 菌 形 态 特 征 生 物 学 特 性 病 菌 呈 短 杆 状 ， 两 端 钝 圆 ， 大 小 为 （ 1 . 5 m 2 . 5 m ） （ 0 . 5 m 0 . 7 m ） ， 多 数 无 鞭 毛 ， 少 数 具 1 根 3 根 极 生 鞭 毛 ， 无 芽 胞 ，
45、 无 荚 膜 ， 革 兰 氏 阴 性 菌 。 病 菌 从 植 物 根 系 或 受 伤 部 位 侵 入 木 质 部 的 维 管 束 ， 并 在 维 管 束 中 大 量 繁 殖 并 迅 速 扩 散 至 整 个 植 株 ， 产 生 大 量 胞 外 多 糖 、 细 胞 壁 降 解 酶 等 物 质 ， 堵 塞 维 管 束 中 的 液 流 运 输 ， 破 坏 导 管 组 织 ， 从 而 引 起 植 物 萎 蔫 死 亡 。 A . 5 木 麻 黄 青 枯 病 病 害 流 行 规 律 通 常 发 生 在 台 风 暴 雨 后 ， 造 成 大 量 树 木 死 亡 ； 积 水 等 低 洼 地 容 易 导 致 病 害
46、 发 生 ； 高 温 干 旱 季 节 是 病 害 的 高 发 期 。D B 4 4 / T 2 3 4 6 2 0 2 1 7 B B 附 录 B （ 规 范 性 ） 培 养 基 及 试 验 方 法 B . 1 C P G （ C a s a m i n o a c i d - P e p t o n e - G l u c o s e ） 培 养 基 蛋 白 胨 1 0 g ， 酪 朊 水 解 物 1 g ， 葡 萄 糖 5 g ， 蒸 馏 水 1 0 0 0 m l ， 琼 脂 1 7 g （ 配 制 液 体 培 养 基 时 不 加 入 琼 脂 ） ， 调 节 P H 至 7 . 0 ，
47、1 2 1 湿 热 灭 菌 2 0 m i n 。 B . 2 T T C 选 择 性 培 养 基 蛋 白 胨 1 0 g ， 酪 朊 水 解 物 1 g ， 葡 萄 糖 5 g ， 蒸 馏 水 1 0 0 0 m l ， 琼 脂 1 7 g ， 调 节 P H 至 7 . 0 ， 1 2 1 湿 热 灭 菌 2 0 m i n 后 ， 温 度 降 至 5 0 左 右 ， 用 过 滤 灭 菌 方 法 加 入 2 , 3 , 5 - 三 苯 基 氯 化 四 氮 唑 （ T T C ） 0 . 0 5 m g / L 。 B . 3 革 兰 氏 染 色 法 B . 3 . 1 结 晶 紫 染 色
48、液 结 晶 紫 1 . 0 g ， 9 5 % 乙 醇 2 0 . 0 m l ， 1 % 草 酸 铵 水 溶 液 8 0 . 0 m l ， 将 结 晶 紫 溶 解 于 乙 醇 中 ， 然 后 与 草 酸 铵 溶 液 混 合 。 B . 3 . 2 革 兰 氏 碘 液 碘 1 . 0 g ， 碘 化 钾 2 . 0 g ， 蒸 馏 水 3 0 0 . 0 m l ， 将 碘 与 碘 化 钾 先 进 行 混 合 ， 加 入 蒸 馏 水 少 许 ， 充 分 振 摇 ， 待 完 全 溶 解 后 ， 再 加 蒸 馏 水 至 3 0 0 m l 。 B . 3 . 3 沙 黄 复 染 液 沙 黄 0
49、. 2 5 g ， 9 5 % 乙 醇 1 0 . 0 m l ， 蒸 馏 水 9 0 . 0 m l ， 将 沙 黄 溶 解 于 乙 醇 中 ， 然 后 用 蒸 馏 水 稀 释 。 B . 3 . 4 染 色 法 染 色 步 骤 如 下 ： a ) 将 涂 片 在 火 焰 上 固 定 ， 滴 加 结 晶 紫 染 色 液 ， 染 1 m i n ， 水 洗 ； b ) 滴 加 革 兰 氏 碘 液 ， 作 用 1 m i n ， 水 洗 ， 用 吸 水 纸 吸 去 水 分 ； c ) 滴 加 9 5 % 乙 醇 脱 色 ， 约 3 0 s ； 或 将 乙 醇 滴 满 整 个 涂 片 ， 立 即 倾 去 ， 再 用 乙 醇 滴 满 整 个 涂 片 ， 脱 色 1 0 s 。 水 洗 ， 吸 去 水 分 ； d ) 沙 黄 复 染 液 染 1 m i n ， 自 来 水 冲 洗 ； 干 燥 ， 镜 检 ； e ) 被 染 成 紫 色 的 细 菌 称 为 革 兰 氏 阳 性 菌 （ G + 菌 ） ， 染 成 红 色 的 称 为 革 兰 氏 阴 性 菌 （ G 菌 ） 。 B . 4 P C R 检 测 方 法 B . 4 .
