1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广东 省 地方标准 DB44/T 2338 2021 实验动物 病原核酸 液相芯片 法定性分 析 Laboratory animals Qualitative analysis of pathogen nucleic acids with suspension array method 2021 - 10 - 18 发布 2022 - 01 - 18 实施 广东省市 场监督 管 理局 发 布 DB44/T 2338 2021 I 目 次 . II 1 . 1 2 . 1 3 . 1 4 . 1 5 . 2 6 . 2 7 . 2 8 . 3
2、 9 . 6 10 . 7 A . 8 B . 9 DB44/T 2338 2021 II 前 言 GB/T 1.1 2020 1 GD/TC 93 DB44/T 2338 2021 1 实 验动物 病原核 酸液相 芯片法定 性分析 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB 19489 GB/T 19495.2 3 术语和 定义 液相芯 片技 术 suspension array technology xMAP - - - 100 4 缩略语 cDNA DNA complementary DNA CPE cytopathic effect DEPC diethyl pyroc
3、arbonate DNA deoxyribonucleic acid MFI median fluorescence intensity PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction RNA ribonucleic acid SA-PE - streptavidin R-phycoerythrin xMAP flexible multi-analyte profiling technology DB44/T 2338 2021 2 5 原理 PCR 5 TAG 3 5 TAG 2 5.6 100 PE Streptavi
4、din SA-PE SA-PE SA-PE 6 主要设 备和 材料 PCR PCR -20 1.5 mL 2 mL 5 mL 15 mL 1 mL PCR 0.2 mL 96 90 mm 150 mm 20 min 7 试剂 GB/T 6682 DNA RNA DB44/T 2338 2021 3 1.25 10 7 beads/mL PBS A PCR DEPC DNA RNA A PrimeScript RT reagent Kit 注： PrimeScript RT reagent Kit PCR QIAGEN Multiplex PCR Plus Kit 注： QIAGEN Multi
5、plex PCR Plus Kit SA-PE 1 mg/mL 1 TM A 5 TAG 3 Spacer 5 biotin HPLC 8 方法 生物安 全措 施 GB 19489 采样及 样本 的处 理 8.2.1 脏器组织 0.5 g 2.0 g 5 PBS 1 min 2 min 4 5 000 g 10 min 8.2.2 盲肠内 容物 或粪 便 1.0 g 2.0 g 5 mL 5 PBS 1 min 2 min 8 000 g 5 min 5 mL 8.2.3 血液样 本 0.2 mL 0.5 mL EDTA 3 5 DB44/T 2338 2021 4 8.2.4 拭子取 样 3
6、 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5 min 5 mL 8.2.5 细胞培 养物 CPE 15 mL 1 500 g 5 min 1 mL PBS 1.5 mL CPE 3 15 mL 8 000 g 5 min 15 mL 8.2.6 细菌分 离培 养物 1.5 mL 8.2.7 饲料、 垫料 和饮 水 5 g 10 g 50 mL 3 PBS 5 min 10 min 15 mL 4 8 000 g 5 min 5 mL 1.5 mL 8.2.8 设施设 备 5 cm 2 15 mL 3 mL PBS 5 min 10 min 4 8 000 g 5 min 5
7、 mL 8.2.9 样本的 存放 2 8 24 h -80 8.2.10 采样废 弃物 处理 样本核 酸提 取 8.3.1 DNA RNA 8.3.2 n 1.5 mL n + + 8.3.3 DNA 2 8 -20 RNA DB44/T 2338 2021 5 PCR PCR -80 核酸扩 增 8.4.1 反转录 （可 选） DNA PCR PCR RNA 1 37 25 min 85 5 s cDNA PCR PCR cDNA -20 -80 500 ng Total RNA 表1 RNA 反 转录 反应 体系 L 5 PrimeScript Buffer 2 1 PrimeScript
8、 RT Enzyme Mix I 0.5 Oliog dT Primer 0.5 25 pmol Random Primer 6 mers 0.5 50 pmol RNA 5 PCR 1.5 10 注： 8.4.2 PCR 8.4.2.1 PCR 反 应体 系 PCR 2 No Template Control NTC 表2 PCR 反 应体 系配 制表 L 2 buffer 10 1 2 200 nmol/L DNA/cDNA 4 PCR 4 20 8.4.2.2 PCR 反 应参 数 DB44/T 2338 2021 6 PCR 3 表3 PCR 反 应参 数 95 2 min 1 95
9、30 s 35 60 90 s 72 30 s 72 10 min 1 注： RT-PCR PCR 产 物杂 交 8.5.1 8.5.2 40 khz 20 s 8.5.3 2 500 1 Tm Hybrdization Buffer 125 / 8.5.4 SA-PE 1 mg/mL SA-PE 1 Tm Hybrdization Buffer 8.5.5 75 SA-PE 37 45 25 min 45 min 液相芯 片检 测仪 读取 荧光 8.6.1 PCR 45 8.6.2 8.6.3 8.6.4 75 50 60 s 8.6.5 8.6.6 30 min 9 结果 数据有 效性 分
10、析 50 100 200 结果计 算 DB44/T 2338 2021 7 Luminex qualitative ratio result LQRR Median florescence intensity MFI MFI MFIB 1 LQRR=MFI/MFIB (1) LQRR MFI MFIB 结果 分 析与 定性 判定 9.3.1 LQRR 3 9.3.2 LQRR2 9.3.3 2 LQRR3 10 防止交 叉污 染的 措施 GB/T 19495.2 DB44/T 2338 2021 8 A A 附录A （规范 性） 溶液的 配制 A.1 0.02 mol/L pH7.2 磷酸 盐
11、 缓 冲液 （PBS ） 的配 制 A.1.1 A液 0.2 mol/L NaH2PO4 H20 27.6 g 1 000 mL A.1.2 B液 0.2 mol/L NaH2PO4 7H2O 53.6 g Na2HPO4 12H2O 71.6 g Na2HPO4 2H2O 35.6 g 1 000 mL A.1.3 0.02 mol/L pH7.2 磷 酸盐 缓冲液 （PBS ） 的配 制 A 14 mL B 36 mL NaCl 8.5 g 800 mL HCl pH 7.2 1 000 mL 121 15 min A.2 无RNase 去 离子 水的 配制 0.1% DEPC 121 1
12、5 min A.3 1TM 杂交 缓冲 液 NaCl 0.2 mol/L Tris 0.1 mol/L Triton X-100 0.08% pH 8.0 4 DB44/T 2338 2021 9 B B 附录B （资料 性） 实验动 物病 原液 相基 因芯 片引物 表B.1 大小鼠 病原 液相 基因 芯片 引物列 表 5 - 3 TMEV TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-GATCTAAGTYAACCGACTCC Bio-GAAGGAAGGGGCAACACATA MHV CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TGGMATCCTC
13、AAGAAGACCACTT Bio-ATGCCMGAAAACCARGAGTAATG MNV TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-spacer18-TCTGTYCTGCGCTGGGTGC Bio-GCTGCGCCATCACTCATCC III REO3 CACTACACATTTATCATAACAAAT-spacer18- CCTCGCCTACGTGAAGAAGT Bio-CATCATCGAGTCCCTGGGTG MVM MVM TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-TTGTTCCACCACCACTAAATG Bio-GGTTTGTGTTCAAGATCT
14、AGTTC MPV MVM ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CACCAGCAACAGACAACCAA Bio-TGAATGCGTTGAGTGTTCTC LCMV AATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-GAGTCCAGAAGCTTTCTGATGTCAT Bio-CAAGTATTCACACGGCATGGAT HV ATACTTTACAAACAAATAACACAC-spacer18-GGACACAATCAATGGGGATACAAC Bio-CCATATCATCCCCTAAGTGGAA SV CTAAACATACAAATACACATTT
15、CA spacer18-CCCAGCCATATACTCAGTCGTGCT Bio-TCCACAACTTTTGTGACAGGACAC PVM ATCTCAATTACAATAACACACAAA-spacer18-GATCACAGAGCCCGTCAAAAT Bio-CATATAACATCCAATACGAGTTTGAA EDIM AATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-ATCAAGCACGATTTGGAAC Bio-GATTCAGTTCGCAATGTAAGTCC DB44/T 2338 2021 10 表B.1 大 小鼠 病原 液相 基 因芯片 引物 列表 5 - 3 Mp
16、ul TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-spacer18-AGCGTTTGCTTCACTTTGAA Bio-GGGCATTTCCTCCCTAAGCT ECT CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TACGGTGTATATGGCTACTCA Bio-ACTGCTGCTTCCTATACTCG MAD TTAAACAATCTACTATTCAATCAC-spacer18-AGACTCACACTGCGTATAGTCC Bio-CCAGAACTCGGTTATCCCCA MCMV CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-GCCCTCT
17、TCATCCCTTACCT Bio-GACCTCCATGTCCTTCATGC POlY ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CCATGCTCCCTTCTATGCGAT Bio-TCAGTCAGCCATAGATGCAA RCV CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-TGGMATCCTCAAGAAGACCACTT Bio-ATGCCMGAAAACCARGAGTAATG RTV ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-GGAAACTTAGAGCAGACATCG Bio-TCCACAGAGAACAACCATCG
18、RMV RMV TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-Spacer18-ACACCATGCCAACTGCAGATG Bio-ATTGTTCACTCCCTGTGTTTGTGTT RRV RPV AATAACAACTCACTATATCATAAC-Spacer18-GATGATAAGCGGTTCAGGG Bio-AAGAGCTCCGGTATCTCTGTC H-1 H1 CTAAACATACAAATACACATTTCA-Spacer18-CTCTAGCAACTCTGCTGAAG Bio-CAGTTATTCCTTGGAGGCAT KRV KRV ATTAAACAACTCTTAACTACACA
19、A-Spacer18-AACCAGACGCTGGAATCGCTAA Bio-TGTAGCAGTCTAGATGCATGA IC ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-spacer18-CGCAGAATCGCAAATACAC Bio-TAACAATAAGCTCGCAGTCG DB44/T 2338 2021 11 表B.2 兔病原 液相 基因 芯片 引物 列表 5 - 3 RHDV CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-CTCTCCACAAAATAACCCATTCACA Bio-CCAACCCTGGTCCAATCTCG RRV TACTACTTCTATAA
20、CTCACTTAAA-spacer18-ATGGTTCGCTTGTGTCTTAGTTG Bio-ATGCGTTGGGTGTAGTTCCTGTA SV CTAAACATACAAATACACATTTCA-spacer18-TGACAACAAACGGAGTAAACGC ACCATAGGTCCAAACAGCCATTC 表B.3 猴病原 液相 基因 芯片 引物 列表 5 - 3 SIV CACTTAATTCATTCTAAATCTATC-spacer18-ACGACCCGGCGGAAAGAAAAAGT Bio-TGCACCAGATGACGCAGACAGT T STLV TTAAACAATCTACTATTC
21、AATCAC-spacer18-GTGCCAATCATGGACCTGCC Bio-TCCTGGAGCGTCGATTAGAAGG SRV ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-AYGGGGCTACTGCYCCATA Bio-GCCATTACCKGCYTGTTGATT 表B.4 禽病原 液相 基因 芯片 引物 列表 5 - 3 AIV TACTACTTCTATAACTCACTTAAA-spacer18-ATGAGTCTTCTACCCGAGG Bio-TCAGAGGTGACAGGATTG NDV ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-CTC
22、ATCTCAGACAGGGTCAATC Bio-ATGGAGTCACCAAGGGG IBV ATTAAACAACTCTTAACTACACAA-spacer18-AATCACGCTCAAGTTCAAGGC Bio-GCATTGTTCCTCTCCTCATC ILTV ATCTCAATTACAATAACACACAAA-spacer18-GCAGCGAAAAGAAGGC Bio-TCATCGTGCTCGGTGTCC MG CACTACACATTTATCATAACAAAT-spacer18-ATCTAAAACCGTGTTGCTAA Bio-AGGAGGTAATCCACCCCCA DB44/T 2338
23、2021 12 表B.4 禽 病原 液相 基因 芯 片引物 列表 5 - 3 MS CTTTCTTAATACATTACAACATAC-spacer18-CCTTTTAGACTGGAATAACGGT Bio-GCTAATGTTCCGCACCC CAV ATACTTTACAAACAAATAACACAC-spacer18-GCTCTCCAAGAAGATACTCCA Bio-GCATTCGCGCAGCCACAC MDV TACTTAAACATACAAACTTACTCA-spacer18-CCCATTCCCTCTTCTGCC Bio-GCTGAGCGTAAACCGTC IBDV TACTTCTTTACT
24、ACAATTTACAAC-spacer18-ATGCGGAGCCTTCTGA Bio-ATTAGCCCTGACCCTGTG REO ACTTATTTCTTCACTACTATATCA-spacer18-GGATTCCGTCTCCATTCT Bio-GAGTTTCCGTCAACCGTA REV CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-spacer18-GACTGCCTTGTGACTGCT Bio-ACTCCCACTGTTGTCTAAATC ALV CTAAACATACAAATACACATTTCA-spacer18-CTGATGCAACAACCAGGAAA Bio-GCAGTAACATTAGTGACATACCC AAV CAAACAAACATTCAAATATCAATC-spacer18-GCGCCBACYCGVAAYGTCA Bio-TTGAARGAVGGHCCBCKGTC AEV AATAACAACTCACTATATCATAAC-spacer18-GTTGAGGATAAGGAACCACAGG Bio-TTACCAGGAGCTAATTCAGGGA DB44/T 2338 2021 13 DB44/T 2338 2021 * 563 1304 510220 020-84250337 DB44/T 2338 2021
