1、 ICS 11.220 CCS B 41 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 1779 2021 仔 猪 肠毒素 性大肠 杆菌反向 间接血 凝试验 操 作 规程 Protocol of reverse indirect hemoagglutination assay for piglet enterotoxigenic escherichia coli 2021 - 12 - 23 发布 2022 - 02 - 23 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 1779 2021 I 目 次 前言 . III 引言 . IV 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定
2、义 . 1 4 仪器与材料 . 1 5 样品的采集和处理 . 2 6 实验步骤 . 2 7 结果判定 . 2 8 生物安全 . 2 附录 A（资料性） 仔猪肠毒素性大肠杆菌 K88、K99 、987P 纤毛抗原的制备 . 3 附录 B（资料性） 培养基和样品稀释液的配制 . 4 附录 C（资料性） 仔猪肠毒素性大肠杆菌 K88、K99 和 987P 纤毛抗体致敏绵羊红细胞的制备 . 5 DB42/T 1779 2021 II DB42/T 1779 2021 III 前 言 本文件按照GB/T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件的某些内
3、容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件 由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提出。 本文件 由湖北省农业 农村厅 归口。 本文件起草单位：湖北省农业科学院畜牧兽医研 究所 、华中农业大学 。 本文件主要起草人： 刘泽文、 田永祥、 袁芳艳、 刘威、 高婷、 郭锐、 杨克礼、 周丹娜、 梁婉 、段 正 赢、 陈文杰、 贝为成 。 本 文件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ：027-87665821 ，邮箱： ； 对本 规程 的有关修改意见建议请反馈至湖北省农业科学院畜牧兽医研究所， 联 系 电 话：027-8
4、7156122 ，邮箱： 。 DB42/T 1779 2021 IV 引 言 仔猪肠毒素性大肠杆菌腹泻， 又称仔猪黄痢， 是由仔猪肠毒素性大肠杆菌 （Piglet enterotoxigenic escherichia coli ，ETEC ）引起。该病常发生于1周龄内的仔猪，以1 日3日龄最常见，死亡率可达到 100% ， 给养 猪生 产带 来极 大的 危害 。 由于 该病 发病 急、 死亡 快， 发病 后药 物治 疗效 果不 佳。 为有 效预 防 和控制本病，急需建立一种快速、敏感、简便的诊断方法。 DB42/T 1779 2021 1 仔 猪 肠 毒 素 性大肠 杆菌反 向间接 血凝 试
5、验 操作规程 1 范围 本文件规定了仔猪肠毒素性大肠杆菌反向间接血凝试验的术语和定义、 试验材料、 样品的采集和处 理、实验步骤、结果判定和生物安全等。 本文件适用于仔猪肠毒素性大肠杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件； 不注日期的引用文件， 其最新版本 （包括所有的修改单） 适用于 本 文件。 NY/T 2839 致仔猪黄痢大肠杆菌分离鉴定技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 仔猪肠毒素性大肠杆菌 enterotoxigenic escherichi
6、a coli ，ETEC 能够产生一种或多种肠毒素的致病性大肠杆菌，是一类可引起初生仔猪腹泻的重要病原菌。 3.2 纤毛抗原 fimbrial antigen 大多数革兰氏阴性菌和少数革兰氏阳性菌的菌体表面遍布的细而 短的丝状物 ，其化学成 分 为 蛋 白 质，具有良好的免疫原性。 4 仪器与材料 4.1 器 材 生物安全柜、 恒温培养箱 、 恒温摇床 、超净工作台、-40 低温 冰箱 、普通冰箱、高压灭菌锅、 电 子天 平 （0.001 g）、 微量移液器(100 L 、200 L 和1 000 L) 、V型血凝板 、 手术 刀、 接种 环、 酒精 灯、 培养 皿、 三角 瓶 （100 mL
7、、500 mL和1000 mL ） 、 高速 冷冻 离心 机 （12000 r/min）、 蛋白 质测 定仪 、 磁力 搅拌 器。 4.2 实验材料 4.2.1 阳性对照：肠毒素性大肠杆菌纤毛抗原，制备方法见附录 A 。 4.2.2 阴性对照：样品稀释液，配制方法见附录 B。 DB42/T 1779 2021 2 4.2.3 培养基：改良 Minca 肉汤 培养基和麦康凯琼脂培养基，配制方法见附录 B 。 4.2.4 大肠杆菌纤毛抗体致敏绵羊红细胞：制备方法见 附录 C 。 5 样品的采集和处理 5.1 样品采集、保存及细菌的分离、纯化：按照 NY/T 2839 中的 方法执行。 5.2 细菌
8、培养和处理： 用无菌接种环挑选单个呈红色或粉色的菌落， 接种改良Minca 肉汤 ，37 100 r/min 120 r/min 振摇培养 8 h10 h 后收集菌液， 室温条件下 5000 r/min 离心 10 min ， 弃上 清， 沉淀 用与原菌液 等体积的样品稀释液重悬后用于检测。 6 实验步骤 6.1 取洁净 V 型血凝板，在样品孔中依次加入待检样品 30 L/孔。 6.2 设置阴性对照和阳性对照各 2 孔，分别加入阴性对照和阳性对照 30 l/孔。 6.3 每孔中加入大肠杆菌 K88 （或 K99 或 987P ）纤毛抗体致敏红细胞 30 L/孔。 6.4 充分混匀，室温静置 3
9、0 min45 min，观察结果。 7 结果判定 7.1 实验结果 实验可能出现以下几种结果： a) “+” ：100% 凝集，致敏绵羊红细胞呈细沙粒样均匀铺于孔底 ； b) “+” ：75% 凝集，致敏绵羊红细胞均匀铺于孔底，但边缘不整且稍向孔底集中 ； c) “+” ： 50 凝集，致敏绵羊红细胞于孔底形成一个环状，四周有小凝集块 ； d) “+” ：25% 凝集，致敏绵羊红细胞于孔底形成圆团，但边缘不够光滑，四周稍有凝集 ； e) “-”：致 敏绵羊红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐。 7.2 成立条件 阳性对照呈“+ ”，阴性对照呈“- ”，试验结果成立。 7.3 判定标准 待检样品
10、出现“ +” 或“+”以上，判定为阳性； 待检样品 呈现“-”时，判定为阴性；介于两者 之间，判为可疑，对可疑样品重新检测1次，仍然可疑的判为阴性。 8 生物安全 8.1 实验操作人员 进行实验前 应穿戴好个人防护用品 。 8.2 实验 过程中涉及到活菌操作， 如细菌的分离、 纯化和细菌培养和处理等， 均应该在 生物安全 II 级 实验室 内进行 。 8.3 实验过程中使用的器材、实验废弃物 如病料、 活菌 及与活 菌接触的器皿、枪头、防护手套等， 均 应进行 无害化 处理。 DB42/T 1779 2021 3 A A 附录A （资料性 ） 仔猪肠毒素性大肠杆菌 K88 、K99 、987P
11、 纤毛抗原的制备 A.1 将含 K88 、 K99 、 987P 纤毛的大肠杆菌接种改良 Minca 肉汤 ， 37 振摇培养 8 h10 h 后收集菌液 。 A.2 将收集的菌液 ， 经 5000 r/min 离心 10 min， 沉淀物用适量 PBS （0.01 mol/L ，pH 值 7.2 ）悬浮 。 A.3 加热至 55 62 ， 以 100 r/min 300 r/min 搅拌 20 min30 min。 A.4 10000 r/min 2 8 离心 30 min ， 取上清 。 加入固体硫酸铵至 30% 饱和度 ，2 8 放置过 夜。 A.5 10000 r/min 2 8 离心
12、 30 min ，收集沉淀 ， 用少量 PBS（0.01 mol/L ，pH 值 7.2 ） 悬浮 。 A.6 2 8 PBS （0.01 mol/L ，pH 值 7.2 ） 透析 24 h48 h 后 ， 即得到纯化的 K88 、K99 和 987P 纤 毛蛋白，测量各纤毛蛋白含量。 DB42/T 1779 2021 4 B B 附录B （ 资料性 ） 培养基和样品稀释液的配制 B.1 改良 Minca 肉汤培养基 准确称取本品17.5 g ， 溶解 于1000 mL蒸馏 水中 ， 加入 甘油5 mL ， 混匀 ，116 高压灭菌30 min ， 冷却 后4 保存备用。 B.2 麦康凯琼脂培
13、养基的配制 准确称取本品50.0 g ， 溶解 于1000 mL蒸馏水中，121 高压灭菌15 min ， 倾注 平板 ， 冷却 后4 保存 备用。 B.3 样品稀释液的配制（以下均使用分析纯度试剂） 氯化钠（NaCl ） 8.0 g 氯化钾（KCl ） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O） 2.9 g 磷酸二氢钠（NaH2PO4 ） 0.2 g 牛血清白蛋白（BSA） 1.0 g 硫柳汞（C9H9HgNaO2S ） 0.2 g 加蒸馏水定容至1000 mL即可，置2 8 保存备用。 DB42/T 1779 2021 5 C C 附录C （资料性 ） 仔猪肠毒素性大肠杆菌 K8
14、8 、K99 和 987P 纤毛抗体致敏绵羊红细胞的制备 C.1 阳性血清的制备及纯化 C.1.1 阳性血清的制备 ： 用PBS （0.01 mol/L ，pH 值7.2 ） 将纯化的纤毛抗原稀释为蛋白质浓度0.5 mg/ mL， 与等量弗氏完全佐剂混合制成乳剂 ， 作为首免抗原 ， 免疫体重1.5 kg 2.0 kg 且 K88、K99 和987P 纤 毛抗体阴性的健康日本大耳白兔 ， 腿部肌肉多点注射 ，2 mL/ 只 。2周后， 用相同抗原与等量弗氏不完全 佐剂混合制成乳剂，作为二免抗原，注射方法与剂量同首免。再过2周进行三免，免疫抗原和免疫方法 同二免。三免2周后用琼脂扩散试验检测血清
15、效价，待血清琼扩抗体效价达1:32 以上时，心脏采血，分 离血清 ， 加0.01% 硫柳汞 ， 经56 水浴灭活30 min ，置-40 保存 。 C.1.2 阳性血清的纯化 ： 取1份阳性血清与4 份醋酸盐缓冲液 （0.05 mol/L ，pH 值3.6 ） 混合 ， 室温搅拌 下逐滴加入正辛酸25 L/mL ； 室温混合30 min ，2 8 静置2 h 以上 ；然后2 8 ，10000 r/min 离心30 min ， 弃沉淀 ； 计上清体积 ， 加入1/10 体积的PBS （0.01 mol/L ，pH值7.2）， 用2 mol/L NaOH 调pH 值至7.4 ； 冰浴下于30 mi
16、n内加入0.277 g/mL 的硫酸铵 ；2 8 静置过夜 ；2 8 ，5000 r/min 离 心30 min ，弃上清 ；沉淀用适量PBS （0.01 mol/L ，pH 值7.2 ）溶解 ， 于50100倍体积的PBS （0.01 mol/ L，pH 值7.2 ） 中置2 8 透析过夜 ， 期间以相同体积的PBS （0.01 mol/L ，pH 值7.2 ） 换液3 4次 ； 收 集透析后样品 ，定量分装 ， 置-40 保存 。 C.2 大肠杆菌纤毛抗体致敏绵羊红细胞的制备 C.2.1 绵羊红细胞的制备 ： 选择健康公绵羊 ， 无菌操作采血 ， 抗凝剂为3.8% 枸橼酸钠 ， 放2 8
17、稳 定35 d 。5 000 r/min 离心10 min后去上清 ， 再用PBS （0.01 mol/L ，pH 值7.2 ） 洗5次 。 C.2.2 红细胞醛化 ：5 份PBS （0.01 mol/L ，pH 值7.2 ） 配成的10% 红细胞悬液 ， 放电磁搅拌器上 ， 逐滴 加 入1份3%戊二醛溶液 ， 加完后继续搅拌数小时至红细胞呈红褐色 ，5 000 r/min 离心10 min 后去上清 ，细 胞沉淀以相同体积的PBS （0.01 mol/L ，pH 值7.2） 悬浮 ， 再5 000 r/min 离心10 min 后去上清 ， 如此重复 洗涤45 次， 用PBS （0.01 m
18、ol/L ，pH 值7.2 ） 配成10% 醛化红细胞 。 加0.01% 硫柳汞 ，2 8 保存 ， 不 超过6个月。 C.2.3 醛化红细胞的鞣化及致敏 ： 用PBS （0.01 mol/L ，pH 值7.2 ） 将纯化好的K88 阳性血清稀释至40 g/mL ，K99 阳性血清稀释至160 g/mL ，987P 阳性血清稀释至80 g/mL 。 取2 份稀释血清与1份CrCl3 溶液 （10 g/mL ） 混合 ，充分混匀 ，37 水浴10 min ；取0.6 份10% 醛化红细胞液 ， 用PBS （0.01 mol/L ，pH 值7.2 ） 洗涤2 次，5000 r/min 离心10 min ， 弃去上清 ， 将血清CrCl3 混合液加入到洗涤过的沉积红细胞中 ， 充分混匀后 ， 立即加入1份1:20000 鞣酸溶液 ， 混匀 ，37 水浴30 min。 用含0.1%BSA 的PBS （0.01 mol/ L，pH 值7.2 ） 洗涤3次 ，5000 r/min 离心10 min ， 弃上清 ， 用8份含0.1%BSA 的PBS （0.01 mol/L ，pH 值7. 2）悬浮红细胞 ，加入0.01% 硫柳汞防腐 ， 即为0.75% 的致敏绵羊红细胞 ，在2 8 放置2 d 3 d。
