1、 ICS 65.020.30 CCS B 43 41 河南省地方标准 DB41/T 2171 2021 牛妊娠诊 断技术规 程 2021 - 10 - 19 发布 2022 - 01 - 18 实施 河南 省市 场监督管理 局 发 布 DB41/T 2171 2021 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范 性引 用文 件 . 1 3 术语 和定 义 . 1 4 直肠 检查 . 1 5 超声 波诊 断 . 2 6 妊娠 相关 糖蛋 白检 测 . 2 附录 A （ 规范 性） 直肠 检查法 不同 妊娠 时期 牛子 宫变化 示例 . 5 附录 B （ 规范 性） 牛配 后各时 期
2、B 型超 声波 子宫 切面示 例 . 7 附录 C （ 规范 性） 溶液 配制方 法和 要求 . 9 DB41/T 2171 2021 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分： 标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定 起草。 本文件 由 河 南省 农业 农村 厅 提出 并归 口。 本文件 起草单 位： 河南省 奶牛生 产性能 测定 中心、 河南省 种牛遗 传性 能测定 中心、 河南农 业大 学 、 河南省 兽药 饲料 监察 所 。 本文件 主要 起草 人： 张震 、 王新 庄、 闫跃 飞、 闫磊 、 汪聪 勇、 苏银 池、 林红 新、 薛 永
3、康 、 许 杨 、 任 小丽、 刘欢、 李静 茹、皇 超英、 郑立、 李秋 平、白 雪利、 高娜、 黄辉 、 岳婷 婷、 巩 丹、侯 玉芳 、李 娜 、 卜秋月 。 DB41/T 2171 2021 1 牛 妊娠诊 断技术规 程 1 范围 本文件规 定了直 肠检查 、 超声 波诊 断、妊 娠相关 糖 蛋白（pregnancy-associated glycoproteins, PAGs） 检测 等牛 妊娠 诊断 方法的 操作 技术 规程 。 本文件 适用 于牛 妊娠 诊断 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。
4、其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB 10152 B型 超声 诊断 设 备 NY/T 3471 畜 禽血 液收 集 技术规 范 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适 用 于本 文件。 3.1 妊娠诊 断 采用临 床或 实验 室的 方法 检查配 种一 定时 间内 的母 牛是否 妊娠 、妊 娠时 间及 胎儿发 育情 况的 方法。 3.2 孕囊 在胚胎 发育 的最 初几 周内 围绕胚 胎充 满液 体的 结构 ， 也是牛 妊娠 过程 中通 过超
5、声发现 妊娠 的第 一 个 结构。 3.3 妊娠相 关糖 蛋白 母牛妊娠后 胎 盘 的 滋 养 层 双 核 细 胞 与 子 宫 上 皮 细 胞 融 合 后 释 放 的 一 种 蛋 白 。 一 般 最 早 可 在妊娠 15 d 21 d 的怀 孕母 牛血 液 中检测 到， 产后90 d 后浓 度降至 最低 。 4 直肠检 查 动物准 备 4.1 动物使 用颈 夹或 保定 架保 定配种45 d 后的 母牛 。 人员准 备 4.2 操作人 员检查 手指 甲并将 手指甲 剪短磨 平， 穿戴已 消毒的 工作服 ，操 作手臂 佩戴一 次性长 臂手 套 ， 并在手 套外 涂抹 润滑 剂。 排空蓄 粪 4.3
6、 DB41/T 2171 2021 2 操作人 员直 检手 手指 并拢 ，以45 60 角缓慢 进 入直肠 ，排 空蓄 粪。 确定子 宫颈 位置 4.4 操作人 员手 臂前 伸， 摸到 子宫体 ，顺 子宫 体回 撤手 臂，确 定子 宫位 置。 妊娠诊 断 4.5 操作人 员经 直肠 触摸 探查 母牛两 侧子 宫角 是否 存在 大小和 质地 差异 ， 判 断是 否存在 孕囊 和子 叶 ， 并 跟踪大 小变 化情 况， 从而 确定母 牛是 否妊 娠。 妊娠 期牛子 宫变 化应 符合 附录A 的规定 。 检查结 束 4.6 检查结 束后 ，将 使用 过的 手套和 工作 服进 行处 置， 同时记 录检
7、 查结 果。 5 超声波 诊断 动物准 备 5.1 使用颈 夹或 保定 架保 定配 种32 d 60 d的 母牛 。 人员准 备 5.2 按4.2 。 排空蓄 粪 5.3 按4.3 。 开机自 检 5.4 选用符 合GB 10152 的B超 仪 。打开B 超仪 开关， 待仪 器 设备自 检正常 后， 设置或 调整设 备相关 参数， 按设备 要求 进行 预热 ，根 据B 超 仪屏 幕影 像质 量调 节 灰度、 对比 度、 增益 度及 近场、 远场 信号 强度 。 获取影 像 5.5 在B超 仪探 头部 位涂 抹相 应 耦合剂 ，将B超 探头 缓慢 送 入直肠30 cm 50 cm 处， 深 度可
8、根 据牛 体型 和 妊娠状 况进 行适 当调 整， 紧贴子 宫不 断缓 慢移 动调 整探查 角度 ，直 至清 晰影 像出现 。 妊娠诊 断 5.6 出现一 个或 多个 规则 的孕 囊 （ 黑色 暗区 ） 或者 胎儿 骨 骼影像 即可 确认 为妊 娠 。 妊娠期 牛子 宫 内 孕囊 及胎儿 变化 应符 合附 录B 的 规定。 检查结 束 5.7 检查结 束后 ， 将使 用过 的 手套和 工作 服进 行处 置 ， 擦拭B 超仪 探头 并使 用75% 的酒精 进行 消毒 ， 同时 记录检 查结 果。 6 妊娠相 关糖 蛋白 检测 样品准 备 6.1 DB41/T 2171 2021 3 采集配 种2
9、8 d后 牛只 血液 并分离 血清 。采 样、 运输 过程应 符合NY/T 3471 的 相 关要求 。 实验前 准备 6.2 实验室 温度 调节 设置18 25 ， 并准 备恒 温箱 、 混匀器 、酶 标仪 等仪 器设 备。 检测程 序 6.3 6.3.1 试剂配制 配制方 法按 附录C规定 。 6.3.2 包被 用包被 液将牛PAGs 单克隆抗体稀 释至工作浓度， 加入酶标 板孔中，每孔100 L（每孔抗体含 量约 35 ng ）， 在2 8 放 置12 h 。 6.3.3 洗涤 弃去孔 内包 被液 ，用 洗涤 液洗板3次 ，每 次300 L/ 孔，洗 涤完 毕后 在吸 水纸 上拍干 。
10、6.3.4 封闭 每孔加 入200 L 的封 闭液 ，置37 孵育1 h。按6.3.3 规定 操作 。 6.3.5 加入待 检样 品 每孔加 入50L样品 缓冲 液 。分别 将100 L标 准品（A F）和 样品 加入到 相应 孔 中，加 样后轻 轻震 荡混匀 。覆 膜，37 孵 育60 min 或室 温（18 25 ）孵 育90 min 。 6.3.6 洗板 孵育后 洗板 ，甩 尽酶 标板 内液体 ，每 孔加300 L洗 涤液洗 板， 并在 吸水 纸上 拍干， 反复 洗涤5次。 6.3.7 加入酶 标兔 抗 牛PAGs 多 克 隆抗体 用洗涤 液将 酶标 兔抗 牛PAGs 多克 隆抗 体稀
11、释至 标定 浓 度， 每 孔加100 L酶 标兔 抗 牛PAGs 多克 隆抗 体， 覆膜，37 避 光孵 育60 min 或室 温（18 25 ） 避光孵 育90 min 。 6.3.8 洗板 重复6.3.6 的操 作 ， 并用 干 净纸巾 将酶 标板 底部 擦拭 干净。 6.3.9 显色反 应 每孔加100 L底 物溶 液。 勿覆膜 ，室 温（18 25 ） 避 光孵 育30 min 。 6.3.10 终止反 应 孵育完 成后 ，每 孔加50L 反应终 止液 ，轻 轻晃 动混 匀。 6.3.11 上机检 测 15 min 内用 酶标 仪在450 nm波长处 测量 各孔 的光 密度 （OD 值
12、 ）。 6.3.12 计算结 果DB41/T 2171 2021 4 以标准 品的 浓度 为横 坐标 （X），OD 值 为纵 坐标 （Y ） ， 绘制 标准 曲线 ， 相 关 系数 （R 2 ） 应 大于 等于 0.99。 根据 样品 的OD 值利 用标准 曲线 计算 出样 品中PAGs浓度 。 结果判 断 6.4 被检牛 只PAGs 检测 浓度1 000 pg/mL时 ，结 果判断 为妊娠 ；PAGs 检测 浓度300 pg/mL 时， 结果 判 断为空 怀状态 ；300 pg/mL PAGs 检测浓 度1 000 pg/mL 时 ，结果 判断 为高风 险，存 在胚胎 死亡 风险， 建议2
13、周 后 复检 。DB41/T 2171 2021 5 A A 附录A （规范 性） 直肠检 查法 不同 妊娠 时期 牛子宫 变化 示例 A.1 未孕牛 子宫卵 巢均位 于骨 盆腔内 ，2 个子 宫角 大小相 等， 形 状相似 ，弯曲 如绵 羊角状 ，角间 沟清楚 明显 。 触诊子 宫有 弹性 ，子 宫角 有收缩 反应 。卵 巢上 无妊 娠黄体 。 A.2 怀孕牛 A.2.1 初期： 子宫变 化不 大，子 宫壁有 弹性， 孕角 侧卵巢 上有突 出于卵 巢表 面的黄 体，同 时观察 是 否 返情。 A.2.2 1个月 ：孕 角增 厚变 粗， 不 收缩， 有弹 性， 孕角 内有 液体波 动。 空角
14、收缩 ，有 弹性， 弯曲 明显 ， 角间沟 清楚 。 图 A.1 妊娠1 个月 子宫 情况 示例 A.2.3 2个月： 角间 沟不 清楚 ， 分 岔明显 ， 子 宫角、 卵巢 向 腹腔沉 入， 孕角 比空 角大 一倍， 子宫 角壁 软 而薄， 有波 动。 图 A.2 妊娠2 个月 子宫 情况 示例 A.2.4 3个月 ： 角 间沟 消失 ， 子 宫 颈移至 耻骨 前缘 ， 孕 角有 明显波 动， 有胎 动。 孕侧 子宫中 动脉 开始 出 现较弱 孕脉 。DB41/T 2171 2021 6 图 A.3 妊娠3 个月 子宫 情况 示例 A.2.5 4个月： 子宫 沉入腹 腔， 可 清楚摸 到子叶
15、 ，体 积稍小 于卵巢 （如黄 豆大 小） ， 孕 侧子宫 中动脉 较 清楚。 A.2.6 5个月： 两侧 卵巢全 沉入 腹 腔，不 能或只 能摸 到子宫 的一部 分，子 叶更 大（如 蚕豆大 小） ， 孕侧 子宫中 动脉 明显 ，非 孕侧 出现孕 脉。 A.2.7 6个月 ：胎 儿进 入腹 腔， 子 叶更大 （如 鸽子 蛋大 小） ， 子宫中 动脉 粗大 ，孕 脉明 显。 A.2.8 7个月 ：子 叶如 核桃 大， 两 侧子宫 中动 脉均 明显 。 A.2.9 8个月 ：子 叶更 大， 两侧 中 动脉孕 脉显 著， 胎儿 上移 。 A.2.10 9个月 ：前 置部 分进 入骨 盆 入口， 两
16、侧 子宫 动脉 有显 著孕脉 。DB41/T 2171 2021 7 B B 附录B （规范 性） 牛配后 各时 期B 型超 声波 子宫切 面示 例 B.1 各时 期B 型 超声 波子 宫切 面示例 出现一 个或多 个规 则的孕 囊暗区 或者胎 儿骨 骼影像 即可确 认为早 孕阳 性（图B.2）， 否则为 早孕 阴 性（图B.1 ）。 图 B.1 未孕子 宫角 图 B.2 子宫内 囊暗 区 牛孕后27 d（图B.3 ）、30 d（图B.4）、32 d （图B.5）、43 d（图B.6 ）、59 d（图B.7）、66 d （图B.8）的B型 超声 波子 宫切面 图示 例如 下： 图 B.3 妊娠
17、 第27 d 图 B.4 妊娠 第30 d DB41/T 2171 2021 8 图 B.5 妊娠 第32 d 图 B.6 妊娠 第43 d 图 B.7 妊娠 第59 d 图 B.8 妊娠 第66 d C C DB41/T 2171 2021 9 D 附录C （规范 性） 溶液配 制方 法和 要求 C.1 洗涤液 将下列 试剂 按次 序加 入1 000 mL 规格 的容 器中 ， 加 入800 mL 蒸馏 水充 分溶 解， 用1 mol/L 盐酸 （HCl ） 或1 mol/L 氢氧 化钠 （NaOH ）调节 至pH 7.4 ，定 容至1 000 mL 。 氯化钠 （NaCl ） 氯化钾 （K
18、Cl） 磷酸氢 二钠 （Na2HPO4-12H2O ） 磷酸二 氢钾 （KH2PO4 ） 吐温-20 （Tween-20 ） 加蒸馏 水至 8.0 g 0.2 g 0.2 g 2.9 g 0.5 mL 1 000 mL C.2 包被液 包被液 为碳 酸盐 缓冲 液（0.025 mol/L ，pH 9.6 ）。 将 下列试 剂按 次序 加入1 000 mL 规格 的容 器中 ， 加入800 mL 蒸 馏水 充分 溶 解，用1 mol/L 盐酸 （HCl ）或1 mol/L 氢氧化 钠（NaOH ）调 节至pH 9.6 ，定 容 至1 000 mL 。 碳酸钠 （Na2CO3 ） 碳酸氢 钠（Na
19、HCO3 ） 加蒸馏 水至 1.59 g 2.93 g 1 000 mL C.3 封闭液 （5% 脱脂 奶） 洗涤液 脱脂奶 粉 100 mL 5 g C.4 底物 四甲基 联苯 二胺 无水乙 醇（C2H5OH ） 加蒸馏 水至 20 mg 10 mL 1 000 mL C.5 终止液 取98% 浓硫 酸55.5 mL 缓慢 加入444.5 mL双 蒸水 中， 混匀， 室温 保存 。 C.6 标准品 取纯化 的妊 娠相 关糖 蛋白 用洗涤 液分 别稀 释至3 500 pg/mL 、 2 370 pg/mL 、 1 610 pg/mL、 1 090 pg/mL 、 500 pg/mL 和 0 pg/mL ，并 分别命 名为 标准 品A 、B、C 、D、E 、F 。
