1、 ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省地方标准 DB37/T 4460 2021 规模化牛 场气溶胶 中口蹄疫 病毒、 牛病 毒性 腹泻病毒 和牛传染 性鼻气管 炎病毒实 时荧 光定量 RT-PCR/PCR 检测技术 规程 Real-time fluorescence quantitative RT-PCR/PCR detection technique for foot-and-mouth disease virus, bovine viral diarrhea virus and infectious bovine rhinotracheitis virus in aero
2、sol of large-scale cattle farms 2021-12-27 发布 2022-01-27 实施 山东省市 场监督 管 理局 发 布 DB37/T 4460 2021 I 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB37/T 4460 2021 1 规 模化牛 场气溶胶 中口蹄 疫病毒、 牛病毒 性腹泻病 毒和牛 传染性鼻 气 管炎病 毒实时荧 光定 量 RT-PCR/PCR 检 测技术 规程 1 范围 RT-PCR/PCR 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 GB 19489 GB/T 27401 3 术语和 定义 4 缩略语 FMD FMDV BVDV IBR
3、V PCR RT-PCR DNA RNA cDNA RNA DNA AGI PBS 5 试剂或 材料 DB37/T 4460 2021 2 5.1 GB/T 6682 DNA/RNAase 5.2 25:24 2 8 A.1 5.3 24:1 2 8 A.2 5.4 0.1 % DEPC 5.5 -20 5.6 75 % A.5 -20 5.7 TE A.6 5.8 2 mol/L NaAc A.7 5.9 FMDV 5 -UTR BVDV 5 -UTR IBRV gD B FMDV BVDV cDNA IBRV DNA 6 仪器设 备 6.1 6.2 PCR 6.3 13 000 r/min
4、 6.4 2 8 -20 6.5 5 L 10 L 100 L 1 000 L 6.6 1.5 mL DNAase RNAase 6.7 100 6.8 6.9 6.10 A 7 气溶胶 样品 7.1 气溶胶 样品 的采 集、 灭活 处理 AGI 1 % C 7.2 样品贮 运 24 h 7.3 样品保 存 2 8 24 h -70 8 实验步 骤 DB37/T 4460 2021 3 8.1 实验室 规范 RT-PCR GB 19489 GB/T 27401 DNAase/RNAase 250 4 h DNAase/RNAase 8.2 样品病 毒核 酸RNA 和 DNA 提取 RNA RN
5、Aase RNAase 8.2.1 样品病 毒核 酸RNA 提取 8.2.1.1 1.5 mL 200 L TRIzol 1 mL 10 min 8.2.1.2 200 L 10 min 8.2.1.3 4 13 000 r/min 15 min 8.2.1.4 10 min 8.2.1.5 4 13 000 r/min 15 min 8.2.1.6 1 mL 75 % 4 8 000 r/min 10 min 5 min 8.2.1.7 50 L TE RNA -20 8.2.1.8 RNA RNA 8.2.2 样品病 毒核 酸DNA 提取 8.2.2.1 1.5 mL 200 L 450
6、L 20 L K 55 15 min 8.2.2.2 700 L 10 min 8.2.2.3 13 000 r/min 15 min 8.2.2.4 24:1 10 min 8.2.2.5 13 000 r/min 15 min 8.2.2.6 1/10 2 mol/L NaAc 10 min 8.2.2.7 13 000 r/min 5 min 1 mL 75 % 8 000 r/min 10 min 5 min 8.2.2.8 50 L TE DNA -20 8.2.2.9 DNA 8.3 实时荧 光定 量 RT-PCR/PCR 扩增 8.3.1 扩增试 剂准 备 PCR n n= +1
7、 +2 20 L RT-PCR D.1 D.2 n+1 PCR 20 L DB37/T 4460 2021 4 8.3.2 加样 PCR 7.2.1.7 RNA 5 L 7.2.2.8 DNA 2 L 500 r/min 30 sec 8.3.3 实时荧 光定 量 RT-PCR 反应 SYBR Green I PCR PCR 42 /15 min 95 /30 sec 94 /15 sec 61 /30 sec 40 40 2 min 61 PCR 8.3.4 实时荧 光定 量PCR 反应 SYBR Green I PCR PCR 94 /3 min 94 /15 sec 61 /30 sec
8、 40 40 2 min 61 PCR 9 结果判 定 9.1 结果分 析条 件的 设定 9.2 质控标 准 9.2.1 Ct 9.2.2 Ct 28 9.2.3 9.3 结果判 定 9.3.1 阴性 Ct FMDV BVDV IBRV 9.3.2 阳性 Ct 30.0 FMDV BVDV IBRV 9.3.3 可疑 Ct 30.0 38.0 DB37/T 4460 2021 5 A A 附录A （资料 性） 溶液配 制 A.1 体积 比25 ：24 的酚 ：氯 仿 溶液 Tris- 50 mL 48 mL 2 8 A.2 体积 比24:1 的 氯仿 ：异 戊 醇溶液 48 mL 2 mL 2
9、 8 A.3 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液 6.055 g Tris 100 mL 80 mL 0.1 %DEPC HCl pH 8.0 100 mL A.4 0.5 mol/L EDTA （pH 8.0 ）溶液 18.61 g Na2EDTA 2H2O 100 mL 80 mL 0.1 % DEPC 10 % NaOH pH 8.0 100 mL A.5 75 % 乙醇 75 mL 25 mL 0.1 % DEPC A.6 TE 缓 冲液 0.5 mL 10 mmol/LTris-HCl(pH8.0) 0.1 mL 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) pH
10、8.0 0.1 % DEPC 50 mL 4 A.7 2 mol/L NaAc （PH 5.2 ） 溶液 16.4 g NaAc 100 mL 40 mL PH 5.2 100 mL DB37/T 4460 2021 6 B B 附录B （资料 性） 阳性质 粒标 准品 的制 备 B.1 引物 B.1 表B.1 引物序 列表 5 -3 CGTTGCACTCCACACTTAC GACCAAGTAGGCGGAAAG ATGACACAGGAAAACATTCCGG CTTCGGTTTGACATCATACACAC GGGCGACTAGAGATACACTCGCC GTTTCGAGAACCAGCAGTCC
11、B.2 PCR 反 应液 配方 PCR B.2 表B.2 PCR 反 应液 配方 1 10 LA Buffer Mg 2+ Plus 5.0 5.0 2 GC Buffer Mg 2+ Plus 25.0 2.5 mM dNTPs 8.0 8.0 8.0 5 0.5 0.5 0.5 (10 0.5 (10 0.5 (10 0.5 (10 0.5 (10 0.5 (10 0.5 33.5 33.5 13.5 cDNA 2.0 cDNA 2.0 DNA 2.0 50 50 50 B.3 口蹄疫 病毒 阳性 质粒 标准 品的制 备 TRIzol 200 L 7.2.1 RNA RNA Ferment
12、asRevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit cDNA cDNA PCR PCR B.2 95 /5 min 94 /15 sec 58 DB37/T 4460 2021 7 /30 sec 72 /30 sec 33 72 /5 min PCR 1% pEAST-T3 DNA https:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi BLAST pEAST-T3-FMDV B.4 牛病毒 性腹 泻病 毒阳 性质 粒标准 品的 制备 200 L 7.2.1 RNA RNA FermentasRevertAid TM Firs
13、t Strand cDNA Synthesis Kit cDNA cDNA PCR PCR B.2 B.3 PCR pEAST-T3 DNA BLAST B.3 pEAST-T3-BVDV B.5 牛传染 性鼻 气管 炎病 毒阳 性质粒 标准 品的 制备 200 L 7.2.2 DNA DNA PCR PCR B.2 B.3 PCR pEAST-T3 DNA BLAST B.3 pEAST-T3-IBRV DB37/T 4460 2021 8 C C 附录C （规范 性） 牛场环 境气 溶胶 样本 的采 集方法 和注 意事 项 C.1 采样环 境 5 C.2 试剂 0.9 % C.3 仪器与
14、耗材 Porton 10 mL C.4 采样人 员要 求 C.5 采样工 具 121 C.6 气溶胶 样品 采样 1.5 m 30 mL Porton 12.5 L/min 30 min 4 2 30 mL 50 mL 70 % 1 % PCR -20 C.7 采样现 场用 具处 理 70 % DB37/T 4460 2021 9 D D 附录D （资料 性） 引物序 列及 荧 光RT-PCR/PCR 反 应液 配方 D.1 引物 D.1 表D.1 引物序 列表 5 -3 CGTTGCACTCCACACTTAC GACCAAGTAGGCGGAAAG TGGTGAGTTCGTTGGATGGCTT
15、AA CCCTATCAGGCTGTATTCGT ACGGACGACGAGCTGGGACT CGGCAGCGAAACCATGAAAT D.2 荧光 RT-PCR 反 应液 配方 RT-PCR/PCR D.2 表D.2 荧光 RT-PCR/PCR 反 应液 配 方 1 -PCR Buffer 10.0 10.0 10.0 ExTaq HS Mix 1.0 1.0 PrimeScript PLUS RTase Mix 0.5 0.5 (10 0.5 (10 0.5 (10 0.5 (10 0.5 (10 0.5 (10 0.5 DEPC 2.5 2.5 7.0 RNA 5.0 5.0 DNA 2.0 20 20 20
