DB37 T 4459—2021 鹅星状病毒感染诊断技术规范.pdf

1、 ICS 11.220 CCS B 41 37 山东省地方标准 DB37/T 4459 2021 鹅星状病 毒感染诊 断技术规 范 Diagnostic technicalspecification for goose astrovirus infection 2021-12-27 发布 2022-01-27 实施 山东省市 场监督 管 理局 发 布 DB37/T 4459 2021 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分： 标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定 起草。 请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。 本文 件的 发布机

2、构不 承担 识别 专利 的责任 。 本文件 由山 东省 畜牧 兽医 局提出 并组 织实 施。 本文件 由山 东省 畜牧 业标 准化技 术委 员会 归口 。 DB37/T 4459 2021 1 鹅 星状病 毒感染诊 断技术 规范 1 范围 本文件 规定了 鹅星 状病毒 感染的 临床诊 断和 实验室 诊断的 技术规 范。 其中临 床诊断 包括流 行病 学 、 临 床 症 状 、 病 理 变 化 ； 实 验 室 诊 断 包 括 样 品 的 采 集 与 保 存 、 病 毒 分 离 鉴 定 、 反 转 录- 聚 合 酶 链 式 反 应 （RT-PCR ） 、实 时荧 光定 量RT-PCR 与 间接 酶

3、联 免疫 吸附试 验（ELISA）。 本文件 适用于 鹅星 状病毒 感染的 诊断、 检测 、监测 和流行 病学调 查。 鹅星状 病毒感 染的流 行病 学 、 临床症 状 、 病 理变 化适 用 于鹅星 状病 毒的 初步 诊断 ； 病 毒分 离 、RT-PCR 和实 时 荧光定 量RT-PCR 检测 方法 适用于 鹅组织 、分 泌物、 排泄物 和病毒 培养 物中鹅 星状病 毒分离 鉴定 及核酸 检测； 间接ELISA 抗体 检 测 方法适 用于 鹅星 状病 毒感 染的抗 体特 异性 血清 学诊 断。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必

4、不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB 19489 2008 实 验室 生物 安全 通用 要求 GB/T 27401 实 验室 质量 控制规 范 动物 检疫 NY/T 541 2016 兽 医诊 断样品 采集 、保 存与 运输 技术规 范 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。 3.1 鹅星状 病毒 感染 goose astrovirus infection 由鹅星 状病 毒引 起的5日龄25日 龄雏 鹅

5、内 脏器 官与 关节发 生严 重尿 酸盐 沉积 的疾病 。 4 实验室 要求 4.1 环境 4.1.1 实验室 符 合GB 19489 2008 和GB/T 27401 要 求。 4.1.2 从事 RT-PCR 工 作的 实验 室 应进 行 分区 ，根 据条 件划 分出前 处理 区、 核酸 提取 区、核 酸扩 增区 、 电泳检 测区 ， 形 成有 效的 物 理隔离 ， 且 为单 一流 向， 不 得倒流 。 特 别注 意电 泳后 的 琼脂凝 胶要 及时 处理 ， 避免对 实验 室造 成污 染。 4.1.3 生物样 品应严 格控 制避免 对环境 造成污 染， 试验结 束后应 将相关 样品 （如血

6、样）进 行无害 化 处 理。 4.2 人员 DB37/T 4459 2021 2 操作人 员应 接受 实验 室生 物安全 、 实验 室质 量管 理 、 血清学 和分 子生 物学 实验 室检测 技术 培训 。 熟 悉临床 诊断、 病理 组织 学 诊断、 生 物样 品处 理、 病 毒 分离， 以 及核 酸提 取、 基 因 扩增等 分子 生物 学技 术， 熟悉RT-PCR 、qRT-PCR与间接ELISA 检 测结 果的 判断 方 法。 5 样品 5.1 仪器设 备 5.1.1 生物安 全柜 。 5.1.2 解剖剪 。 5.1.3 解剖盘 。 5.1.4 镊子。 5.1.5 组织匀 浆器 。 5.2

7、 试剂与 材料 5.2.1 磷酸盐 缓冲 液（PBS ）， 见A.1 。 5.2.2 青霉素 （100 000 IU/mL）。 5.2.3 链霉素 （100 mg/mL ）。 5.2.4 离心管 。 5.2.5 样品保 存管 。 5.2.6 滤器（ 孔 径0.22 m ）。 5.3 样品采 集与 运送 5.3.1 总则： 样品采 集、 保存、 运输应 按 照 NY/T 541 2016 技术 规范 进行。 采样 和 样品前 处理 过程 中 应戴一 次性 手套 、口 罩、 帽子， 采样 过程 中样 品不 得交叉 污染 。 5.3.2 组织样 品：采 集疑 似鹅星 状病毒 感染死 亡鹅 的肝脏 、

8、脾脏 和肾脏 等组 织样品 。采集 病料时 ， 用 无菌手 术剪 取组 织样 品， 置于样 品保 存管 中， 密封 、编号 。 5.3.3 泄殖腔/喉 拭子 样品 ：活 禽 泄殖腔/喉 拭子 样品 ，置 于 样品保 存管 中。 5.3.4 血清样 品： 用无 菌注 射器 采血 1 mL ，将 其注 入 1.5 mL 无菌 eppendorf 管 中， 于 37 静置 2 h 。 分离的 血清 转入 新的 无 菌eppendorf 管中 ， 加 盖， 编 号， 待 检。 采集 的血 清样 品应无 溶血 ， 置 于离 心管 中。 5.3.5 鹅胚尿 囊液 ：将 鹅胚 尿囊 液加入 无 菌 eppe

9、ndorf 离 心管中 ，加 盖， 编号 ，待 检。 5.3.6 所有样 品应 置于 密闭 容器 中冷藏 运输 ，保 存温 度在-15 以下 ，时 间不 超过 24 h。 5.4 样品处 理与 保存 5.4.1 样品应 在生 物安 全柜 中进 行处理 ， 取 10 g20 g 样 品放入 灭菌 的研 钵中 磨碎 。研磨 充分 的组 织 置于含 青霉 素 （2 000 IU/mL ） 、 链 霉素 （2 mg/mL ） 、 庆大霉 素 （50 g/mL ） 和 制霉菌 素 （1 000 IU/mL ） 的pH 值7.0 7.4 的 等渗 磷酸盐 缓冲 液 （PBS ，A.1 ） 中， 配 制 成

10、 10 % 20 % （g/mL） 的悬 液。 样 品经10 000 r/min 离心30 min ， 取 上清液 经 0.22 m 滤器 过 滤除菌 后， 作为 接种 和检 测材料 。 5.4.2 泄殖腔/ 咽喉拭 子置 于含青 霉素（2 000 IU/mL ）、 链 霉素（2 mg/mL ）、 庆大 霉 素（50 g/mL ） 和制霉 菌素 （1 000 IU/mL ）的 pH 值 7.0 7.4 的 PBS 中。 样品 剧烈 震荡 后，10 000 r/min 离心 10 min ， 取上清 作为 检测 材料 。 5.4.3 鹅胚尿 囊液 在4 下经 10 000 r/min 离心 10

11、 min ，将 上清液 转入 无 菌 eppendorf 管 中， 加盖 ， 编号， 待检 。 DB37/T 4459 2021 3 5.4.4 所有样 品保 存温 度在-15 以下 ，不 超 过2 wk ；-70 贮 存不 超过 30 d 。 5.5 检测要 求 在每次 检测 过程 中， 需要 设置相 应的 阳性 对照 和阴 性对照 。 6 临床诊 断 6.1 流行病 学 鹅群发 病日 龄集 中于5日龄20日龄，5 日龄 左右 开始 发病 ， 死 亡率 逐渐 升高 ，10日龄15日 龄为 死 亡高峰 ，鹅 群的 死亡 率为20 %30 %， 最高 可达50 % 。 6.2 临床症 状 患病雏

12、 鹅表 现为 精神 沉郁 、卧地 倦动 、采 食减 少、 排白色 稀便 。 6.3 剖检变 化与 组织 学变 化 死亡雏 鹅剖 检变 化主 要表 现为内 脏器 官和 关节 腔有 大量尿 酸盐 沉积 ， 包括 心 脏、 肝脏 、 肾脏 及输 尿 管等， 有的 病例 表现 为肾 脏出血 肿大 。 患 鹅组 织学 变化主 要表 现为 肾小 管上 皮细胞 坏死 、 间 质 出 血 ， 肾 小球肿 胀， 脾脏 有 大 量红 细胞浸 润， 肝细 胞空 泡变 性、尿 酸盐 沉积 。 6.4 临床诊 断结 果判 定 同时符 合6.1 、6.2 、6.3 ， 则判断 为疑 似鹅 星状 病毒 感染。 7 病毒分

13、离鉴 定 7.1 病毒分 离 7.1.1 仪器设 备与 材料 7.1.1.1 不同温 度的 冰箱 （2 8 、-20 、-70 ）。 7.1.1.2 37 恒温 孵化 箱。 7.1.1.3 4 离 心机 。 7.1.1.4 打孔器 。 7.1.1.5 1 mL 注 射器 。 7.1.1.6 石蜡。 7.1.1.7 照蛋器 。 7.1.1.8 13 日 龄鹅 星状 病毒 血清 抗 体阴性 鹅胚 。 7.1.2 样品接 种和 培养 7.1.2.1 将处理 后的 样品 上清 ，经 绒毛尿 囊腔 途径 无菌 接种 13 日龄 鹅胚 ，0.2 毫升/枚，37 孵 育 ， 连续观 察6 d。 7.1.2.

14、2 弃去 24 h 内 死亡 鹅胚 ，24 h 144 h 内 死亡 和存 活鹅 胚置于 4 冰箱 过夜 或-20 冷 冻 1 h ， 分别无 菌收 集尿 囊液 并进 行无菌 检查 ，无 菌尿 囊液 盲传三 代。 7.1.3 病毒分 离结 果判 定 DB37/T 4459 2021 4 组织样 品处理 液接 种鹅胚 后，当 胚体3 d5 d 内出 现 死亡， 且胚体 尿囊 膜增厚 ，死亡 鹅胚全 身皮 肤 及胚体 腹膜 有点 状出 血斑 ，肝脏 、肾 脏、 肺脏 均呈 现点状 出血 等变 化， 可判 断为鹅 疑似 星状 病毒 感染。 7.2 病原检 测 7.2.1 RT-PCR 反应 7.2.

15、1.1 仪器设 备 7.2.1.1.1 生物安 全柜 。 7.2.1.1.2 PCR 基 因扩 增仪 。 7.2.1.1.3 台式低 温高 速离 心机 （最 大转速 为 15 000 r/min）。 7.2.1.1.4 无RNA 酶离 心管 （1.5 mL ）。 7.2.1.1.5 PCR 反 应管 （0.2 mL ）。 7.2.1.1.6 微量移 液器 （最 大量 程分 别为 10 L 、20 L 、100 L、1 000 L ）。 7.2.1.1.7 无RNA 酶带 滤芯 枪头 。 7.2.1.1.8 核酸电 泳仪 。 7.2.1.1.9 核酸电 泳槽 。 7.2.1.1.10 紫外凝 胶

16、成 像仪 。 7.2.1.1.11 电子天 平： 精度 为 0.01 g 。 7.2.1.1.12 电磁炉 或微 波炉 。 7.2.1.2 试剂与 材料 7.2.1.2.1 DEPC 水。 7.2.1.2.2 商品 化RNA 提取 试剂 盒。 7.2.1.2.3 RT 反 应试 剂盒 。 7.2.1.2.4 PCR 反 应试 剂。 7.2.1.2.5 1.0 % 琼脂 糖凝 胶， 见 A.2 。 7.2.1.2.6 1TAE 缓 冲液 ，见 A.3 。 7.2.1.2.7 核酸染 料。 7.2.1.2.8 核酸电 泳加 样缓 冲液 ， 见A.4 。 7.2.1.2.9 DNA 分 子量 标准

17、，要 求在100 bp 2 000 bp 之间 ， 有5 条以 上的 指示 条带 。 7.2.1.2.10 阳性对 照标 准品 ， 使 用鹅 星状病 毒SDPY 株（CCTCC NO: V201808 ， 见附 录 C ） ，或其 他背 景清楚 的鹅 星状 病毒 。 7.2.1.2.11 阴性对 照标 准品 ，为 健康 鹅正常 组织 或未 感染 鹅星 状病毒 鹅胚 尿囊 液。 7.2.1.2.12 RT-PCR 检 测所 需引 物： 上游引 物F ：5 - TGGTGGTGYTTYCTCAARA -3； 下游引 物R ： 5 -GYCKGTCATCMCCRTARCA-3 ， 扩 增片 段 长度

18、 为 601 bp， 引物 浓度 为 10 mol/L 。 7.2.1.3 试验程 序 7.2.1.3.1 RNA 提取 按RNA 提取 试剂 盒说 明书 提 取样品 和对 照组 的RNA 。 提 取的RNA 应 立即 检测 ， 否 则 应置于-70 冻 存。 7.2.1.3.2 RT-PCR 反应 7.2.1.3.2.1 反转录 体系 及程 序 DB37/T 4459 2021 5 RNase Inhibitor 0.5 L ，M-MLV buffer 2 L，Random Primers 1.0 L ，dNTPs （2.5 mmol/L ） 1 L ， RNase M-MLV 0.5 L

19、， RNA 模板5 L， 共计10 L。 反 转录 反应 程序 为30 10 min ， 42 60 min ， 70 15 min ，4 终止 。 7.2.1.3.2.2 PCR 反 应体 系及 程序 在试剂 准备 区配 制PCR 反 应 液， 在样 品制备 区进 行加 样， 反应 体系如 下 ：10 PCR Buffer 2.5 L， dNTPs （2.5 mmol/L ）2 L ， 引物F （10 mol/L）和R （10 mol/L）各0.5 L ， 模板cDNA 3 L，rTaq DNA聚 合酶0.25 L ，加DEPC 水至25 L。 瞬时离 心 ， 置 于PCR 基 因扩 增仪内

20、 进行 扩增 ， 反应 程 序为 ：94 预 变性5 min ；94 30 s ，55 30 s，72 30 s，30个 循环 ；72 延 伸10 min 。 7.2.1.3.2.3 琼脂糖 凝胶 电泳 1.0 % 琼脂 糖凝 胶板 的制 备 ： 称 取1 g 琼脂 糖， 加入100 mL 1TAE 缓冲 液中 。 加 热 融化后 加5 L 核酸 染料溶液 ，混匀后倒入放置在水平 台面上的凝胶盘中，胶板 厚5 mm 左右 。依据样品数 选用适宜的梳子 。 待凝胶 冷却 凝固 后拔 出梳 子（胶 中形 成加 样孔 ）， 放入电 泳槽 中， 加1 TAE 缓冲液 淹没 胶面 。 加样： 取6 L

21、8 L PCR 扩增产 物和2 L加 样缓 冲 液混匀 后加 入一 个加 样孔 。每次 电泳 同时 设标 准DNA Marker 、 阴性 对照 、阳性 对照 。 电泳： 电压80 V 100 V或 电流40 mA 50 mA ， 电泳30 min40 min 。 最后 ， 由 凝 胶成像 系统 观察 并拍 照记录 。 7.2.1.4 结果判 定 7.2.1.4.1 试验成 立的 条件 阳性对 照出 现601 bp 的扩 增条带 ，且 阴性 对照 无扩 增条带 时， 判定 试验 结果 成立。 7.2.1.4.2 试验结 果的 判定 7.2.1.4.2.1 在试验 成立 的前 提下 ， 待 检样

22、品 出 现 601 bp 的条 带 ， 判 定待 检样 品为 鹅星状 病毒 PCR 阳 性，必 要时 ，对 扩增 片段 进行序 列测 定。 7.2.1.4.2.2 在试验 成立 的前 提下 ，待 检样品 无条 带， 则为 鹅星 状病 毒 PCR 阴性 （ 见 B.1 ）。 7.2.2 实时荧 光定 量 RT-PCR 7.2.2.1 仪器设 备 7.2.2.1.1 生物安 全柜 。 7.2.2.1.2 台式低 温高 速离 心机 （最 大转速 为 15 000 r/min）。 7.2.2.1.3 无RNA 酶的 离心 管（1.5 mL ）。 7.2.2.1.4 无RNA 酶的 荧光 定 量 PCR

23、 管。 7.2.2.1.5 微量移 液器 （最 大量 程分 别为 10 L 、20 L 、100 L、1 000 L ）。 7.2.2.1.6 无RNA 酶带 滤芯 的枪 头。 7.2.2.1.7 荧光定 量PCR 仪。 7.2.2.2 试剂与 材料 7.2.2.2.1 DEPC 水。 7.2.2.2.2 商品 化RNA 提取 试剂 盒。 DB37/T 4459 2021 6 7.2.2.2.3 一步法 荧光 定 量 RT-PCR 试 剂盒。 7.2.2.2.4 阳性对 照标 准品 ， 使 用鹅 星状病 毒 SDPY 株（CCTCCNO ：V201808 ） ， 或其 他背 景清楚 的鹅 星

24、状病毒 。 7.2.2.2.5 阴性对 照标 准品 ，为 健康 鹅正常 组织 或未 感染 鹅星 状病毒 鹅胚 尿囊 液。 7.2.2.2.6 荧光定 量 RT-PCR 检 测所 需 引物及 探针 ： 上游引 物F ：5 - GGTGGGCTAATAACGGAACTCAG-3； 下游引 物R ：5 - GACCTATTTCCTTGCGGATCAC -3； 探针P：5FAM-TCGGCTCAACATCGCTGATGGG-BHQ3 ， 扩增片 段长 度 为89 bp ， 引 物浓度 为 10 mol/L 。 7.2.2.3 试验程 序 7.2.2.3.1 RNA 提取 RNA 提 取参 照7.2.1

25、.3.1 。 7.2.2.3.2 实时荧 光定 量 RT-PCR 反 应 体系及 程序 在实验 室洁 净区 域， 将试 剂盒中 预混 液、 引物 和探 针取出 ， 置 于冰 上融 化， 将下列 试剂 一次 加 入 到 无RNA 酶的 荧光 定量PCR 管 中。反 应体 系如 下：2One Step RT-PCR Buffer 10 L，Takara Ex Taq HS 0.4 L ，PrimeScript RT Enzyme MixII 0.4 L，引物F （10 mol/L ） 和引物R （10 mol/L ）各 0.4 L ，探针P （10 mol/L ）0.8 L ，模板RNA 2 L

26、，加ddH2O 至20 L 。反应液混匀后置于 LightCycler 96荧 光定量PCR 仪按 照以下 程序 进行扩 增：42 反 转录5 min，95 10 s ；95 变 性5 s ， 60 退火20 s （收 集信 号 ），进 行40 个循 环。 7.2.2.4 结果判 定 7.2.2.4.1 试验成 立的 条件 阳性对 照出 现S 型扩 增曲 线 ， 且阴 性对 照无 扩增 曲线 时，判 定检 测结 果有 效。 7.2.2.4.2 试验结 果的 判定 7.2.2.4.2.1 Ct 值30 ，且 出现S 型 扩 增曲线 ，表 明样 品中 存在 鹅星状 病毒 ，判 定为 阳性 。 7.

27、2.2.4.2.2 无Ct 值， 且无 扩增 曲线 ， 或 Ct 值35 ， 表明 样品 中 无鹅星 状病 毒， 判定 为阴 性。 7.2.2.4.2.3 30Ct 值35 的样 品， 判 定为可 疑， 需重 新检 测（ 见B.2 ）。 8 病毒抗 体检 测（ 间 接ELISA ） 8.1 仪器设 备 8.1.1 台式高 速离 心机 （最 大转 速为 15 000 rpm ）。 8.1.2 酶标仪 。 8.1.3 微量移 液器 ：最 大量 程分 别为 10 L 、20 L 、100 L、1 000 L 。 8.1.4 聚苯乙 烯板 。 8.1.5 水平振 荡器 。 8.1.6 37 培养 箱。

28、 8.2 试剂与 材料 DB37/T 4459 2021 7 8.2.1 标准阳 性血 清， 见 D.1 。 8.2.2 标准阴 性血 清， 见 D.2 。 8.2.3 鹅星状 病毒 抗原 ， 见 D.3 。 8.2.4 酶标二 抗： 兔抗 鹅辣 根过 氧化物 酶标 记 的IgG ，效 价应 在 1:32 以 上。 8.2.5 包被液 ， 见A.5 。 8.2.6 洗涤液 ， 见A.6 。 8.2.7 样品稀 释液 （封 闭液 ）， 见 A.7 。 8.2.8 底物溶 液，TMB 底物 显色 液。 8.2.9 终止液 （浓 度 为2 M ）， 见A.8 。 8.3 操作步 骤 8.3.1 将O

29、RF2 蛋 白抗 原按 照浓 度 为 6.5 mg/mL 用1 碳酸 盐 缓冲液 （pH9.6 ） 稀释2 000 倍， 每孔100 L 加入 到 96 孔 聚苯 乙烯 板 中，4 孵 育过 夜。 孵育 后洗涤 液 洗5 次 ，甩 干板 上残余 液体 。 8.3.2 用样品 稀 释 液将 被检 血清 样品稀 释 40 倍 ，注 意不 要 稀释对 照血 清。 确保 每个 样品换 一个 吸头 ， 做好样 品的 标记 。稀 释的 样品血 清充 分混 匀后 ，加 入包被 孔。 8.3.3 每孔加 入200 L 封 闭液 ，37 温 箱孵 育1 h ，用8.3.1 方法 洗板 。 8.3.4 在A1 、

30、A2 孔各 加100 L 阴性血 清对 照，A3 、A4 孔 各加100 L 阳 性血 清对 照。 8.3.5 将100 L 稀释 好的 待检 血清加 入其 他各 孔， 混匀 后，37 孵育1 h，用 8.3.1 方 法洗 板。 8.3.6 酶标二 抗用 样品 稀释 液 按1:200 倍稀 释 ， 每 孔加 入 100 L ， 37 孵 育1 h，用 8.3.1 方 法洗 板 。 8.3.7 每孔加 入100 L TMB 显 色液，37 避 光条 件下 孵 育 15 min 。 8.3.8 每孔加 入 50 L 终 止液 ， 轻轻振 荡， 终止 反应 。 8.3.9 将酶标 板置 于酶 标仪

31、中， 于 450 nm 测定 各孔 样品 的 吸光值 （OD ）。 8.4 结果判 定 8.4.1 试验成 立的 条件 鹅星状病毒间接ELISA 检测 方法阴性对照OD均值=（ODA1 +ODA2 ）/2；阳性对照OD 均值=（ODA3 + ODA4 ） /2； 阳 性对 照平 均值 减去 阴性对 照平 均值 ， 其 差必 须大于0.04 ； 阴 性对 照平 均值必 须小 于等 于0.17，试 验条件 成立 ，否 则重 复测 定。 8.4.2 试验结 果的 判定 8.4.2.1 当样 品OD450 0.21 时 ，样 品判定 为鹅 星状 病毒 抗体 阳性。 8.4.2.2 当样 品OD450

32、0.17 ， 样品 判定为 鹅星 状病 毒抗 体阴 性。 8.4.2.3 当样 品0.17 OD450 0.21 ，判为 可疑 ，需 重复 测定 。 9 鹅星状 病毒 感染 综合 判定 根据第6章 、第7 章、 第8 章 中的判 定结 果， 可对 鹅星 状病毒 感染 进行 综合 判定 。 9.1 若患鹅 与 第6 章 中所 描述 相符， 且 第 7 章 、 第8 章 中 结果均 呈阳 性， 则可 判定 为 鹅星状 病毒 感 染 。 9.2 若患鹅 与 第6 章 中所 描述 部分相 符， 但 第 7 章、第 8 章 中结 果均 呈阳 性， 则 可判定 为鹅 星状 病毒 感染。 9.3 若患鹅 在

33、 第 7 章中 的结 果 呈阳性 ，但 在 第 8 章中 的 结果呈 阴性 ，也 可判 定为 鹅星状 病毒 感染 。反 之则不 成立 。 DB37/T 4459 2021 8 A A 附录A （资料 性） 相关试 剂的 配制 （试 剂要 求分析 纯） A.1 磷酸盐 缓冲 液（PBS ，0.01 mol/L pH 7.4 ） NaCl 8.0 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g Na2HPO4.12H2O 0.2 g 水加至 1 000 mL A.2 1.0 % 琼脂 糖凝 胶的 配制 琼脂糖 1.0 g 0.5 TAE 电 泳缓 冲液 加至 100 mL 微波炉 中完全 融化

34、，待冷 至50 60 时加 入核 酸 染料， 摇匀。 倒入 板上凝 固后， 取下梳 子， 备 用。 A.3 1 TAE 电 泳缓 冲液 的配 制 A.3.1 配制0.5 mol/L 乙二 胺四 乙 酸钠（EDTA-Na2 ）溶 液（pH 8.0 ） 乙二胺 四乙 酸钠 （EDTA-Na2.2H2O ） 18.61 g 灭菌双 蒸水 80.0 mL 氢氧化 钠调pH至 8.0 水加至 100 mL 用于配 制A.3.2 中的50 TAE 电泳 缓冲 液。 A.3.2 配制50 TAE 电 泳缓 冲液 羟基甲 基氨 基甲 烷（Tris ） 242 g 冰醋酸 57.1 mL 0.5mol/L 乙

35、二胺 四乙 酸钠 （EDTA-Na2 ）溶 液（pH 8.0 ） 100 mL 灭菌超 纯水 加至 1 000 mL 用于配 制A.3.3 中的1 TAE 电泳缓 冲液 。 A.3.3 配制1 TAE 电泳 缓冲 液 50 TAE 电 泳缓 冲液 20 mL 水加至 1 000 mL A.4 核酸电 泳加 样缓 冲液 （10 ） 聚蔗糖 25 g 灭菌双 蒸水 100 mL 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯 青 0.1 g A.5 包被液 （0.05 mol/L pH 9.6 ） DB37/T 4459 2021 9 Na2CO3 0.275 6 g NaHCO3 0.621 6 g 水加至 100

36、 mL A.6 洗涤液 PBS 1 000 mL Tween-20 0.5 mL A.7 样品稀 释液 （封 闭液 ） 脱脂奶 粉 5.0 g 洗涤液 100 mL A.8 终止液 （2 M） H2SO4 （98 % ） 58 mL 水 442 mL DB37/T 4459 2021 10 B B 附录B （资料 性） PCR 及 荧光 定量PCR 结果 图 B.1 PCR 产 物大 小对 照 M 为分子量标准；1 为阴性对照 ，2 为阳性对照。 图B.1 PCR 产 物大 小对 照图 B.2 荧光定 量PCR 扩增 曲线 1 为阳性对照，2 为阴性对照。 图B.2 荧光定 量PCR 扩 增曲

37、 线DB37/T 4459 2021 11 C C 附录C （资料 性） 阳性对 照病 毒（SDPY ） C.1 SDPY 鹅星 状病 毒的 来源 SDPY 鹅 星状 病毒 ， 是一 种 鹅源病 毒 ， 由 山东 农业 大 学禽病 学实 验室 分离 并鉴 定， 保藏 于中 国典 型培 养物保 藏中 心（CCTCC ） ， 其保藏 编号 为CCTCC NO: V201808 。该 病毒 可由 山东 农 业大学 禽病 学实 验室 提 供，由13日 龄血 清抗 体阴 性鹅胚 接种 病毒 后， 收集 死亡胚 体尿 囊液 后离 心所 得 ， 病毒 滴度 10 5.0 ELD50 。 C.2 SDPY 鹅

38、星 状病 毒涉 及的 专 利信息 该病毒 株涉 及以 下专 利： 一种防 治新 型鹅 星状 病毒 的灭活 疫苗 及其 制备 方法 。 专 利号 ：ZL 2018 1 0494586.X ， 专 利公布 日 ： 2020.06.12 。专 利申 请人 ：山东 农业 大学 。 DB37/T 4459 2021 12 D D 附录D （资料 性） ELISA 抗原 和血 清标 准 D.1 鹅星状 病毒 阳性 血清 制备 用鹅星 状病毒SDPY 株感染3周龄4周龄健康雏 鹅，感染后2周采血，分离 血清，-15 以下保存 。 用于鹅 星状 病毒ELISA 抗 体 检测。 【性状 】-15 以下 ，淡 黄

39、色固 体， 室温 下可 融化 。 【无菌 检验 】按 现行 中 国兽药 典 附录 方法 进行 检验， 应无 菌生 长。 【效价 测定 】用 中和 试验 测定， 对100 ELD50 鹅星 状 病毒SDPY 株 的中 和效 价不 低于5 。 D.2 鹅星状 病毒 阴性 血清 制备 健康雏 鹅在隔离器中饲 养至34周龄 ，采血，分离血清，-15 以下保存。用于鹅 星状病毒ELISA 抗体检 测。 【性状 】-15 以下 ，淡 黄色固 体， 室温 下可 融化 。 【无菌 检验 】按 现行 中 国兽药 典 附录 方法 进行 检验， 应无 菌生 长。 【效价 测定 】用 中和 试验 测定， 对100 E

40、LD50 鹅 星状 病毒SDPY 株 的中 和效 价不 高于1:2 。 D.3 鹅星状 病毒 抗原 制备 D.3.1 目的基 因扩 增及 原核 表达 载体构 建 根据SDPY 株ORF2 基因 序列 设计一 对特 异性 引物 ，序 列如下 ： ORF2-F ：5 -CCATGGCTGATATCGGATCCATGCCACAGGCAGAATCCAG-3； ORF2-R ：5 -TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGTCGACTCATGTCCGCCCTT-3 ，扩增片段长度为759 bp ， 引 物 浓度为10 mol/L 。 （下 划线分 别为BamH 与Sal 酶切 位点 ） 对SDPY 株的ORF2 基因 序列 进行扩 增后 ， 纯 化回 收该 片 段， 同 时对 原核 表达 载体PET-32a 进行 双酶 切， 构建ORF2-PET 32a 重 组表 达载体 。 D.3.2 ORF2重 组蛋 白表 达及 纯化 在0.1 mmol/L IPTG 浓度 下 诱导4 h ，进行 蛋白 表达。 经SDS-PAGE 电泳后 ，蛋 白 以包涵 体形式 表达 ， 大小为44 KD。 同 时 利用 镍柱 进 行 蛋 白 纯 化， 纯 化 后的 蛋 白 浓 度6.5 mg/mL ， 以此 作 为 本 文 件 间接ELISA 方法的 包被 抗原 。