1、ICS 65.020 B 16 DB36 江 西 省 地 方 标 准 DB36/T 15262021 山药主要病原线虫鉴定技术规程 Technical regulation for identification of the main pathogenic nematode of Chinese yam 2021 - 12 - 14发布 2022 - 06 - 01实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 15262021 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 符号 . 1 5 设备和试剂 . 2 6 样品采集与分离 .
2、2 7 形态学鉴定 . 2 8 分子鉴定 . 4 附录 A（规范性） 线虫玻片标本制作方法. 6 附录 B（规范性） 山药主要病原线虫形态特征图. 8 附录 C（规范性） 山药主要病原线虫分子鉴定系统发育树. 10 DB36/T 15262021 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省农业科学院农业应用微生物研究所、吉安市农业科学研究所、吉安市永丰 县蔬菜产业发展中心、吉安市泰和县
3、塘洲镇人民政府。 本文件主要起草人：范琳娟、徐雪亮、刘子荣、喻吉生、涂年生、康宏波、胡平华、姚英娟。 DB36/T 15262021 1 山药主要病原线虫鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了山药主要病原线虫南方根结线虫和咖啡短体线虫的术语和定义、符号、设备及试剂、 样品采集与分离、形态学鉴定方法和分子生物学鉴定方法。 本文件适用于山药等块茎类植物根部和土壤及栽培介质中的南方根结线虫和咖啡短体线虫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 南方根结线虫 Meloidogyne incognita (Kofold&White, 19
4、19) Chitwood, 1949 中文名：南方根结线虫 分类地位： 线虫门 （Nematoda） 、 侧尾腺纲 （Secernentea） 、 垫刃目 （Tylenchida） 、 异皮科(Heteroderidae)， 根结线虫属( M e l o i d ogy n e)。 南方根结线虫幼虫属于移动性内寄生， 雌虫为固定内寄生。 寄主范围很广， 通常可危害几百种植物， 主要发生在植物根部，其中侧根和须根最易受害。受害根系常形成大小和形状不同的瘤状根结，使植物 根系吸收、输送养分和水分的能力降低；地上部表现为营养不良，矮化、瘦弱、生长缓慢。 3.2 咖啡短体线虫 Pratylenchus
5、 coffeae (Zimmermann, 1898) Filipjev& Schuurmans Steckhven, 1941 中文名：咖啡短体线虫 分类地位： 线虫门 （Nematoda） 、 侧尾腺纲 （Secernentea） 、 垫刃目 （Tylenchida） 、 短体科(Pratylenchidae)， 短体线虫属（ P r at y l e n c h u s） 咖啡短体线虫属于三类检疫性线虫，属多食性的植物寄生线虫，可寄生250多种植物，主要农作物 寄主包括山药、马铃薯、芋头、玉米和姜等，在我国多个省份均有广泛分布。其属于寄主根系皮层的迁 移性内寄生线虫，受害根系常出现褐色病
6、斑，伴随次生病原物，引起根部腐烂，发生严重会引起植株死 亡。 4 符号 L虫体体长（m或mm）； DB36/T 15262021 2 a体长/最大体宽； b体长/虫体前端至食道与肠连接处的距离； b体长/虫体前端至食道腺末端的距离； c体长/尾长； St口针长度（m）； T泄殖腔开口至精巢末端的距离100/体长； V虫体前端至阴门的距离100/体长； t a i l尾长（m）； D E G O背食道腺开口至口针基部球距离（m）。 5 设备和试剂 5.1 主要设备 生物显微镜、体视显微镜具投射光源、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机（2000 rmp以上）。 5.2 主要试剂 5.2.1 形
7、态学鉴定用试剂 指甲油、 4%甲醛、甘油、乳酚油（苯酚20 mL、乳酸20 mL、甘油40 mL和蒸馏水20 mL混合而成）、 石蜡、95%酒精。 5.2.2 分子生物学鉴定用试剂 单条线虫DNA提取裂解液、灭菌ddH 2 O、琼脂糖、 1TAE、蛋白酶K、 Prime STAR Max premix(2)、 Premix Taq(Ex Taq version 2.0 plus dye)、Goldview核酸染料、100 bpDNA ladder marker、DNA克隆试剂 盒、大肠杆菌DH5感受态细胞。 6 样品采集与分离 6.1 外观症状检查 对待检测植物样品根及根茎部分进行检查，查看是
8、否有根结或根腐症状，收集上述可疑植物材料及 其根际土壤，一并带回实验室检验。 6.2 线虫分离 对采集到的可疑植物材料，轻轻在自来水下冲洗干净表面，削取 1mm2 mm表皮后，切碎剩余的 植物材料，用贝尔曼漏斗法分离表皮和植物中的线虫。 7 形态学鉴定 7.1 南方根结线虫形态鉴定特征 雌虫：虫体膨大呈梨形，白色或乳白色，体前部延伸如颈状，唇区稍凸起，略呈帽状，口针强大。 会阴花纹背弓高、近方形，有平滑到波浪状的线纹组成，侧线不明显，侧线处线纹有分叉，有些线纹弯 向阴门。 DB36/T 15262021 3 雄虫：体形细长，蠕虫状，侧区通常有4条侧线。头部常具有23条不完整环纹，头冠高且宽，有
9、 一中部凹陷的唇盘。口针强大，发育良好，长23m25m，基部球明显，背食道腺开口距口针基部球 距离较近，约2m4m，尾部端圆，无交合伞。交合刺长35 m 二龄幼虫：头冠明显，口针纤细，基部球较小，呈圆形，中食道球椭圆形，瓣门明显，有明显的尾 透明区，尾端有缢缩，尾部末端尖圆或钝圆，热杀死后体形向腹部弯曲呈C形， 透明尾长6 m13.5 m。 具体玻片制作方法和形态特征图分别详见附录 A和附录 B.1。 7.2 南方根结线虫测计值 7.2.1 雌虫 L(20)=500 m723(609) m；体宽=331m520(415) m；口针基部球宽度(10)=3 m5(4) m； St(10)=13 m
10、 16(14) m； D E G O(8)=2 m4(3) m；中食道球长度（10）=37 m63(46) m；中食 道球宽度（10）=31 m49(39) m (Whitehead, 1968)。 7.2.2 雄虫 L(14)=1108 m1953(1583) m； a=31.455.4(46.3)； S t(13)=-23 m32.7(25) m； D E G O(4)=1.4 m2.5(2.1) m； b(12)=13.820.5(17.4)； c(13)=97255(146)；中食道球长度(12)=14.4 m25.2(20) m；中食道球宽度(12)=8.6 m15.8(11.2)
11、m；交合刺长度(12)=28.8 m40.3(35.2) m；引带长度（7） =9.4 m13.7(11.2) m (Whitehead, 1968)。 7.2.3 二龄幼虫 L=337 m 403(371) m； a=24.931.5(28.3)； b(21)=2.023.14(2.36)； b(24)=6.48.4(7.1)； t a i l=38 m55(46) m； c=6.910.6(8.1)； S t=9.6 m11.7(10.5) m； 中食道球长度(24)=10.1 m12.9(11.3) m； 中食道球宽度(24)=5.8 m8.3(7.3) m (Whitehead, 19
12、68)。 7.3 咖啡短体线虫形态鉴定特征 雌虫：虫体粗胖，环纹明显，侧区通常有4条刻线。温热杀死后虫体伸直或呈C形，头骨架发达， 唇区较平，略有缢缩，口针短粗，基部球圆至椭圆形；中食道球近似卵圆形，肠的前端被食道腺从腹面 和侧面覆盖，覆盖长度约为体宽的13倍；排泄孔位于食道-肠瓣门的前方，半月体紧靠排泄孔的前部； 卵母细胞单行排列，前端直或有回折，受精囊大，宽卵圆形至圆形；幼龄雌虫尾长约为肛门处体宽的2 2.5倍，老熟雌虫尾长约为体宽的1.52倍；尾部宽圆或平截，侧尾腺孔小，位于尾部的中前部。 雄虫：口针基部球较雌虫窄，交合刺细长、成对，位于肛门到尾端处，引带46 m，其他特征与 雌虫相似。
13、 具体玻片制作方法和形态特征图分别详见附录 A和附录 B.2。 7.4 咖啡短体线虫测计值 7.4.1 雌虫 L=0.45 mm0.70 mm； a=2535； b=57；c=1722； St=15 m18 m； V= 5426 7683 3.28 (Sher&Allen, 1953)。 L=0.59 mm； a=34； b=6； c=21； S t=18 m； V=81 (新模标本)。 7.4.2 雄虫 L=0.45 mm0.70 mm； a=2640； b=67； c=1724； T=4552； S t=15 m17 m (Loof, 1960)。 DB36/T 15262021 4 7.
14、5 形态学鉴定结果判定 符合7.1和7.2中描述的形态特征的线虫，可初步确定为南方根结线虫；符合7.3和7.4中描述的形态特 征的线虫，可初步确定为咖啡短体线虫。 8 分子鉴定 8.1 DNA 提取 在山药病原线虫形态学鉴定的基础上，分别随机挑取根结线虫和短体线虫各10条，采用单条线虫 DNA提取方法。在显微镜下，用挑针挑取单条线虫至具100 L去离子水的洁净载玻片上漂洗3次，将其 挑至含有8 L去离子水的PCR管中，加入1 L 10PCR Buffer（Mg 2+ free），放入液氮中1 min，转入95 水浴锅中加热2 min，反复冻融3次，加入1 L 1mg/mL 蛋白酶K，置于65水
15、浴锅中温育1 h-2 h，95 条件下保温10 min，使蛋白酶K失活。取出后12000 rmp离心1 min，取其上清液用于PCR扩增或者置于 -20保存。 8.2 PCR 扩增 8.2.1 根结属线虫鉴定引物 根 结 属 线 虫 鉴 定 采 用 线 粒 体 Nad5 基 因 片 段 上 游 引 物 NAD5F2 ： 5-TATTTTTTGTTTGAGATATATTAG-3 ； 下 游 引 物 NAD5R1 ： 5-CGTGAATCTTGATTTTCCATTTTT-3。 8.2.2 短体属线虫鉴定引物 第一对引物：上游引物 28S-D2A：5-ACAAGTAECGTGAGGGAAAGTTG-
16、3，下游引物 28S-D3B： 5- TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3； 第二对引物：上游引物 AB28： 5-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3，下游引物 TW81： 5-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3。 8.2.3 PCR 扩增体系和条件 反应体系： DNA粗提液： 10 L， Prime STAR Max premix(2)： 25 L， 2条引物各1 L（10 mol/L）， 最后加去离子水13 L补至50 L。 PCR扩增条件： 94预变性3 min， 94变性30 s， 45退火30 s， 72延伸1 min，共35个循环， 72 保温10 m
17、in，于4保存。 其中引物NAD5F2/NAD5R1退火温度为45， 28S-D2A/28S-D3B和AB28/TW81 退火温度均为55。 8.3 电泳检测 取5 L扩增产物，加约2 L染料在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像仪观察电泳条带。 8.4 测序 取20 L PCR扩增产物，送测序公司进行双向测序；留剩余25 L PCR扩增产物保存于4冰箱中， 若测序出现双峰，将剩余PCR产物连接至pGEM-T 载体上，转化至大肠杆菌DH5感受态细胞，做菌液 PCR扩增， 反应体系： Ex-rTaq premix(2)： 12.5 L， 2条引物各1 L， 模板： 2 L， 去离子水补足至25
18、L，DB36/T 15262021 5 扩增程序：94预变性10 min，94变性30 s，45退火30 s，72延伸1 min30 s，共30个循环，72保 温10 min，于4保存。取5 L电泳检测有条带后，再送测序公司进行双向测序。 A 8.5 分子鉴定结果判定 符合7.1和7.2中形态特征的可疑线虫， 采用线粒体Nad5基因片段作为引物扩增的基因序列为562 bp， 并采用MEGA软件邻接法构建系统发育树发现其与南方根结线虫聚在同一个分支上， 可判定检测的线虫 为南方根结线虫。系统发育树见附录C.1。 符合7.3和7.4中形态特征的可疑线虫，采用28S-D2A/D3B和AB28/TW8
19、1作为引物扩增的基因序列分 别为770 bp和889 bp，并基于ITS序列构建系统发育树发现其与咖啡短体线虫聚在同一个分支上，可判定 检测的线虫为咖啡短体线虫。系统发育树见附录C.2。 DB36/T 15262021 6 A B 附 录 A （规范性） 线虫玻片标本制作方法 A.1 线虫杀死 在生物体式显微镜下，挑取少量线虫放置凹玻片的水滴中，将其在酒精灯上方火焰上来回移动56 s，以恰好杀死线虫。杀死大量线虫，可将线虫液置于65水浴锅中5 min。 A.2 线虫固定 少量线虫杀死后，可将线虫挑至4%甲醛液中固定；大量的线虫被杀死后，在线虫悬液中加等浓度 双倍的固定液即可。 A.3 临时玻片
20、标本的制作 以4%甲醛液为浮载剂，滴适量于载玻片上，用挑针挑数条线虫于浮载剂中，并使其完全下沉。浮 载剂边缘均匀放置3 mm5 mm长，直径与线虫体宽相近的玻璃纤维丝3根，加盖玻片。用滤纸吸去溢 出的浮载剂，用指甲油封片。待指甲油干后再加封一次，可保存几天至数周。 A.4 永久玻片标本的制作 A.4.1 脱水 采用甘油酒精快速脱水法（Seinhorst, 1959）脱水。将固定好的线虫移入含有FA（4:1）固定液（95% 酒精20 mL，甘油1 mL，蒸馏水79 mL）的贝氏小皿中，将其放入充满饱和酒精蒸汽的（1/10 体积的95% 酒精）的干燥器内，密封后置于3540恒温箱中，保持至少12
21、h；取出小皿后，在解剖镜下小心吸 去上层液体（由于酒精的沉积，小皿里的液体会增加），加入少量甘油酒精混合液（甘油5 mL，95% 酒精95 mL）；将小皿放至在培养皿中，置于40恒温培养箱中至少3 h，待酒精完全挥发后，将线虫移 至纯甘油液中。 A.4.2 制片 A.4.2.1 线虫永久玻片制作方法：将直径 1.5 cm 的打孔器在酒精灯火焰上加热后，插入到蜡盘中蘸取 少量石蜡，迅速轻按于载玻片中央，待冷却后即形成一个蜡圈。在蜡圈内滴一小滴乳酚油（用量以盖上 盖玻片不外溢为宜）作为浮载剂，将已脱水的数条线虫跳入其中，排列整齐，并使其安全下沉。将与线 虫体宽相近的玻璃纤维丝均匀置于浮载剂边缘，加
22、盖玻片后，将载玻片移至 6570的加热板上融蜡， 待石蜡融化后移至实验台上冷却，最后贴上标签。 A.4.2.2 根结线虫会阴花纹玻片制作方法： 1) 将解剖出的根结线虫雌成虫放在透明培养皿内的1滴 45%乳酸中； 2) 用解剖刀将雌虫颈部切去或用细针刺破颈基部，轻压虫体将内含物从切口挤出，再从虫体 后部约1/3处将虫体后部切下； DB36/T 15262021 7 3) 用特制的竹针尖端的纤丝将虫体后部表质层内侧的内含物、粘边物轻轻剔除，直到看到会 阴的轮廓为止； 4) 将会阴角质层挑至1滴纯甘油中，以会阴为中心，将其四周角质层切下，最好切成方形。 用纤丝进一步清理内侧，使其不粘连任何内含物；
23、 5) 将会阴花纹成品转移至载玻片上的 1滴纯甘油中，使其外侧朝上，内侧朝下，用毛发针平 压使之平展，避免上浮； 6) 在载玻片周围放置玻璃纤维丝作为盖玻片支撑物，盖上盖玻片，并用封固剂封固边缘，晾 干后即可观察。 C DB36/T 15262021 8 B D 附 录 B （规范性） 山药主要病原线虫形态特征图 A2龄幼虫整体 F雄虫中食道球 B2龄幼虫口针及中食道球 G雄虫侧线 C2龄幼虫尾部 H雄虫尾部 D雄虫整体 I雌虫会阴花纹 E雄虫口针 图 B.1 南方根结线虫主要形态鉴定特征图 DB36/T 15262021 9 A雌虫整体 D雌虫尾部 B雌虫口针 E雌虫侧线 C雌虫中食道球 F雌虫阴门和后阴子宫囊 图 B.2 咖啡短体线虫主要形态鉴定特征图 DB36/T 15262021 10 C E 附 录 C （规范性） 山药主要病原线虫分子鉴定系统发育树 注：图中黑体字代表从江西省山药上分离到的南方根结线虫。 图 C.1 南方根结线虫的系统发育树 DB36/T 15262021 11 注：图中黑体字代表从江西省山药上分离到的咖啡短体线虫。 图 C.2 咖啡短体线虫的系统发育树 _
