1、 ICS 65.020.30 CCS B 41 35 福建省地方标准 DB35/T 20342021 鸭瘟强弱毒核酸鉴别诊断技术 Quarantine protocol for virulent and attenuated strains of duck plague virus infection 2021 - 12 - 29发布 2022 - 03 - 29实施 福建省市场监督管理局 发布DB35/T 20342021 I 目次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 缩略语 . 1 5 疫病概述 . 1 6 聚合酶链反应 . 2 7 结
2、果判定 . 3 附录 A（规范性） 试剂的配制 . 4 附录 B（资料性） 电泳图 . 6 附录 C（资料性） 参考序列 . 7 DB35/T 20342021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由福建省农业科学院提出。 本文件由福建省农业农村厅归口。 本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心、龙岩市动物 疫病预防控制中心、福州市动物疫病预防控制中心、三明市动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：万
3、春和、黄瑜、傅光华、陈长福、刘道泉、陈小丽、程龙飞、刘荣昌、施少华、 陈红梅、傅秋玲、江南松、李中华。 DB35/T 20342021 1 鸭瘟强弱毒核酸鉴别诊断技术 1 范围 本文件规定了鸭瘟强弱毒核酸鉴别诊断的聚合酶链反应（PCR）的操作技术。 本文件适用于鸭瘟强弱毒核酸实验室鉴别诊断和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 3 术语和定义 本文件没有需
4、要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） dNTP：三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleoside triphosphate） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction） TAE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethyl aminomethane-boric acid- ethylene diamine tetraacetic acid） 5 疫病概述 5.1 鸭瘟 鸭瘟，又称为鸭病毒性肠炎，最早于1923年在荷兰发生和流行，随后在世界多国均有
5、报道，几乎所 有的雁形目禽类（如多品种鸭、鹅和天鹅）均可发生鸭瘟。黄引贤等于1957年在广州发现鸭瘟后，在我 国南方主要养鸭区广泛流行，给养鸭业曾造成巨大的直接经济损失。 5.2 UL2基因特点 鸭瘟病毒，又称为鸭肠炎病毒或鸭疱疹病毒1型，是引起雁形目禽类发生鸭瘟的病原。鸭瘟弱毒， 即鸭瘟活疫苗毒，自1960年以来一直用于防控鸭瘟。鸭瘟病毒UL2基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，是一个 非必需基因，在DNA复制过程中可将脱氧尿嘧啶核苷三磷酸错误插入或是胞嘧啶的脱氨基造成的尿嘧啶 残基切除，保证DNA复制的正确性和顺利进行。对GenBank中登录的鸭瘟病毒（强毒株和弱毒株）的UL2DB35/T 20
6、342021 2 基因进行分析比较发现，强毒株UL2基因长度为1 002 bp，而弱毒株UL2基因长度为474 bp，且与强毒株 UL2基因相比具有528 bp核苷酸序列缺失。 6 聚合酶链反应 6.1 主要仪器设备 6.1.1 PCR仪。 6.1.2 高速台式冷冻离心机。 6.1.3 微量移液器。 6.1.4 组织匀浆器。 6.1.5 电泳仪。 6.1.6 电泳槽。 6.1.7 紫外凝胶成像系统。 6.2 试剂 6.2.1 水，应符合 GB/T 6682 所规定一级水的要求。 6.2.2 磷酸盐缓冲液，配置方法应符合附录 A 中A.1的规定。 6.2.3 10%十二烷基磺酸钠溶液，配置方法应
7、符合附录 A 中A.2 的规定。 6.2.4 蛋白酶 K 溶液，配置方法应符合附录 A 中A.3的规定。 6.2.5 3M 乙酸钠溶液，配置方法应符合附录 A 中A.4的规定。 6.2.6 1TAE 电泳缓冲液，配置方法应符合附录 A 中A.5 的规定。 6.2.7 1.0%琼脂糖凝胶，配置方法应符合附录 A 中A.7 的规定。 6.2.8 10加样缓冲液，配置方法应符合附录 A 中A.8 的规定。 6.2.9 引物（Primer）：10 mol/L。根据鸭瘟强弱毒的 UL2 基因保守区设计，对鸭瘟强弱毒扩增片 段大小分别为 1 019 bp和 491 bp。 上游引物UL 2F：5- TAA
8、CGTCGTTTATACTGTTCCAC -3。 下游引物UL 2R：5- AGACCCAAATGACAGAACCT -3。 6.3 样品处理 将采集的组织（肝脏、食道粘膜假膜）经剪碎处理后，与磷酸盐缓冲液按体积比1:3的比例制成组 织匀浆液，反复冻融3次，4 000 r/min离心30 min，取上清液冻存分装备用。 6.4 核酸 DNA提取 6.4.1 取 420 L 组织匀浆上清液和 30 L核糖核酸酶加入 1.5 mL灭菌离心管混匀后，室温（20 25 ）作用20 min。 6.4.2 加入 40 L 10%十二烷基磺酸钠溶液和 10 L 蛋白酶 K 溶液，56 水浴2 h。 6.4.
9、3 加入等量的 Tris饱和酚，颠倒充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min，小心吸取上层水相于另 一 1.5 mL 灭菌离心管中。 6.4.4 加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1），颠倒充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min，小心 吸取上层水相于另一 1.5 mL 灭菌离心管中。 6.4.5 加入 1/10 体积的 3M 乙酸钠和 2 倍体积冰冻预冷的无水乙醇混匀后，-20放置 1 h。DB35/T 20342021 3 12 000 r/min离心15 min， 去上清。 加入 600 L 75%冰冻预冷的乙醇清洗 2次， 倒置于吸水纸上 5 min，
10、 室温晾干。加入 20 L灭菌双蒸水溶解，-20 放置备用。 6.4.6 核酸 DNA 提取也可采用市售等效的商品化核酸 DNA 提取试剂盒，按说明书的要求进行操作。 6.5 对照 以56 30min灭活的鸭瘟强毒、弱毒病毒提取的基因组DNA或目的片段为阳性对照，以其他灭活的 病毒或健康鸭组织提取的基因组DNA为阴性对照，以灭菌双蒸水为空白对照。 6.6 PCR 扩增 6.6.1 PCR 反应体系为 50 L，每个 PCR 反应管的反应液配置为：依次加入 10PCR 缓冲液 5 L， 上/下游引物各 1 L、dNTP Mixture（各 2.5 mM）4 L、提取的核酸 DNA 2 L、Taq
11、聚合酶 1 L， 加水至总体积 50 L。2 000 r/min离心 15 s。 6.6.2 将 PCR 反应管置于 PCR 仪进行 PCR 扩增。反应条件：94 预变性 5 min；循环参数为 94 变 性 50 s，55 退火 30 s，72 延伸60 s，循环35 次；第三步 72 再延伸 10 min 结束。 6.6.3 PCR 扩增也可采用市售等效的商品化 PCR 检测试剂盒，按说明书的要求进行操作。 6.7 电泳 用1TAE电泳缓冲液配置1.0%的琼脂糖凝胶。 将凝胶放入水平电泳槽， 使电泳缓冲液刚好淹没胶面。 取5 L PCR扩增产物与0.5 L 10加样缓冲液混合，然后加入到1
12、.0 %琼脂糖凝胶板的加样孔中。在 电泳时，使用5 L DNA相对分子量标准物（DL 2 000 DNA Marker）作对照。以5 V/cm的电压进行电泳， 30 min后在紫外凝胶成像系统观察结果。 7 结果判定 7.1 试验成立的条件 当鸭瘟强毒阳性对照、鸭瘟弱毒阳性对照分别出现约1 019 bp和491 bp的特异性条带，阴性对照、 空白对照均无扩增条带（见附录B），试验结果成立。 7.2 试验结果判定 当待检样品出现约1 019 bp条带，判定为鸭瘟强毒阳性；当待检样品出现约491 bp条带，判定为鸭 瘟弱毒阳性；当待检样品出现约1 019 bp和491 bp两个条带，判定为鸭瘟强毒
13、、鸭瘟弱毒双阳性；当待 检样品无特异性扩增条带（见附录B），判定为鸭瘟强毒、鸭瘟弱毒双阴性。 必要时，将目的条带进行胶回收后克隆测序，待测样品的测序结果与参考序列进行比较。与参考序 列（见附录C中的C.1）核苷酸同源性在99.0 %以上，判为鸭瘟强毒阳性；与参考序列（见附录C中的C.2） 核苷酸同源性在99.0 %以上，判为鸭瘟弱毒阳性。 DB35/T 20342021 4 A A 附录A （规范性） 试剂的配制 A.1 0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS） NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO412H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g 将上述试剂溶于800 mL水中，
14、定容至1 000 mL，高压灭菌后4 保存。 A.2 10%十二烷基磺酸钠溶液 取10 g的SDS粉末溶解在70 mL水中，加热到70 ，搅拌待完全溶解后，定容到100 mL，高压灭菌 后室温保存。 A.3 蛋白酶 K（10 mg/mL） 取100 mg的蛋白酶K溶解在6 mL水中，定容到100 mL，-20 保存。 A.4 3M乙酸钠（Ph5.2） 取408.1 g三水乙酸钠溶解于700 mL水中，用冰乙酸调节pH至5.2，定容到1 000 mL，高压灭菌后室 温保存。 A.5 1TAE 电泳缓冲液 A.5.1 配制0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠
15、 18.61 g 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 定容至100 mL A.5.2 配制50TAE电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0） 100 mL 灭菌双蒸水 定容至 1 000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。 A.5.3 配制1TAE电泳缓冲液 50TAE电泳缓冲液 20 mL 灭菌双蒸水 定容至1 000 mL DB35/T 20342021 5 A.6 溴化乙锭溶液 溴化乙锭 20 mg 灭菌双蒸水 定容至20 mL 也可采用市售商品化的更环保、更安全Goldviewer等荧光染
16、料。 A.7 1.0%琼脂糖凝胶 琼脂糖 1.0 g 1TAE电泳缓冲液 定容至100 mL 置微波炉中加热至完全融化，待冷至50 60 时，加溴化乙锭（EB）溶液5 L，摇匀后倒入 制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。 A.8 10加样缓冲液 聚蔗糖 25 g 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯青 0.1 g 灭菌双蒸水 定容至100 mL DB35/T 20342021 6 bp B B 附录B （资料性） 电泳图 鸭瘟强弱毒核酸PCR检测结果电泳图见图B.1。 标引序号说明： MDL 2 000 DNA Marker； 1鸭瘟弱毒阳性对照； 2鸭瘟强毒阳性对照； 3阴性对照； 4空白对照；
17、5待检样品-鸭瘟弱毒阳性； 6待检样品-鸭瘟强毒阳性； 7待检样品-鸭瘟强弱毒双阳性； 8待检样品-鸭瘟强弱毒双阴性。 图B.1 鸭瘟强弱毒核酸 PCR检测结果电泳图 2000 1000 750 500 250 100 6 M 1 2 3 4 5 7 8 DB35/T 20342021 7 C C 附录C （资料性） 参考序列 C.1 鸭瘟强毒参考序列 TAACGTCGTTTATACTGTTCCACAAGGAAGTTGCCAGTCAACCGGCTCAACGCCACGACCTTCCAGGTATTCATTGGCCTTTTTAAAAT GATCACATAAGATGAATGGCTTTCTAGACAGC
18、GGTGATGGATGGCTATATTTCAAAACACAATGCTTGCGACAATTCGGTTTGAACGCT TCCTGAGCATGCACGCCCCACAGCATAAACACTAATCCTTCCTTATTGTCATGTAACCATTGTAATACAGATTTGACTATTTTTGACCA ACCAACGTCTACATGCGATCCCGGATGCCCCTTTCGTACTGTGAGGGTGGTATTTAACAACAAAACTCCAGCTTTGGCCCATGCCTCTA GGCAGCCATGATCAACAATTTTCGTCTCTGGGTAAGAGCGCCGAACGGCCGATAATATATTA
19、CGTAGGCTAGGAGGTATCTGAATACCT CTCCGCACGCTGAATGCGAGCCCGTGAGCCTGGCCGGGTTGATGATATGGATCTTGCCCAACTATGATGACTTTTACATCCGATGGAGC ACAGTACCTCGTCCATGTAAATATTTCATTTTTTGGCGGCAGGACTTCTTCGATGTCACAGCGCCGTTCATACTCAAGTAATACTCGAG ACCCCACTTCCGATTGTAGCTCTTGGTATAATACTTCCCGCCAAGCATCGCCAATACAATAATCGCCGCTCAATTTTTCCCACTCGGTG GG
20、ACTATTAAACCACGAAGGCGCGACCTCACCGCGACCGCTGCTGTTCGACGTCTGAGGTTGTTGTGCTATACCGCCCCCCTCCCTCAT ACAGGCAACGAAACCCGCTGGCGCACCACAAGGCCTGCGTCGTTTCGGCGCCTGGGACGGAGACGGGAGCCTATCGTCGGCCATGGTGT CCGGGTTCACTTTTGTCATGTCTTCGGCCATATCTCGAGTCTGGATCGAATGCATAACGGATGCTGGCCTGAGGGTCTTTGAAGCGATG CATATTCGCGTTTCCGTGGCAGGTTCTGTCAT
21、TTGGGTCT C.2 鸭瘟弱毒参考序列 TAACGTCGTTTATACTGTTCCACAAGGAAGTTGCCAGTCAACCGGCTCAACGCCACGACCTTCCAGGTATTCATTGGCCTTTTTAAAAT GATCACATAAGATGAATGGCTTTCTAGACAGCGGTGATGGATGGCTATATTTCAAAACACAATGCTTGCGACAATTCGGTTTGAACGCT TCCTGAGCATGCACGCCCCACAGCATAAACACTAATCCTTCCTTATTGTCATGTAACCATTGTAATACAGATTTGACTATTTTTGACCA ACCAACGTCTACATGCGATCCCGCTGGCGCACCACAAGGCCTGCGTCGTTTCGGCGCCTGGGACGGAGACGGGAGCCTATCGTCGGCCA TGGTGTCCGGGTTCACTTTTGTCATGTCTTCGGCCATATCTCGAGTCTGGATCGAATGCATAACGGATGCTGGCCTGAGGGTCTTTGAA GCGATGCATATTCGCGTTTCCGTGGCAGGTTCTGTCATTTGGGTCT
