1、ICS 13.100 C 50 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB32/T 3762.16 2021 新型冠状 病毒检测 技术规范 第16 部分 ： 核酸数 字 PCR 法 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 16: Novel coronavirus nucleic acid digital PCR test procedure 2021-12- 09 发布 2022 - 01 - 09 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3762.16 2021 I 目 次 前 言 . II 1 范
2、围 . 1 2 规 范性 引用 文件 . 1 3 术 语和 定义 . 1 4 缩 略语 . 1 5 原理 . 1 6 基 本要 求 . 2 7 试 剂与 材料 . 2 8 仪 器与 设备 . 2 9 操 作步 骤 . 2 DB32/T 3762.16 2021 II 前 言 DB32/T 3762 新 型冠 状病 毒检测 技术 规范 目 前分 为以下 部分 ： 第1部 分： 生物 样本 采 集、运 输和 保存 ； 第2部 分： 病毒 分离 与 鉴定； 第3部 分： 核酸 荧光PCR 检测 程序 ； 第4部 分： 重组 酶介 导 等温扩 增程 序； 第5部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 酶联
3、 免疫 吸附检 测 程序； 第6部 分： 血清IgM 和IgG 抗体 胶体 金免 疫层析 检 测程序 ； 第7部 分： 空气 样本 检 测与评 估； 第8部 分： 物体 表面 检 测与评 估； 第9部 分： 医务 人员 职 业暴露 检测 与评 估； 第10部 分： 微量 血清 中和试 验； 第11部 分： 全基 因组 高通量 测序 ； 第12部 分： 药物 体外 抗病毒 效果 测定 ； 第13部 分： 叠氮 溴化 丙锭- 荧光PCR 检测 程序 ； 第14部 分：N 亚基 因 组荧光PCR 检测 程序 ； 第15部 分： 血清/ 血浆IgM 和IgG 抗 体磁 微粒 化学 发光法 检测 程序
4、； 第16部 分： 核酸 数字PCR 法； 第17部 分： 核酸 检测 用假病 毒阳 性质 控品 ； 第18部 分： 规模 化核 酸检测 程序 。 本 文件 为 DB 32/T 3762 的第16 部分 。 本 文件按照 GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构 和起草规则的规定 起草。 本 文件 由江 苏省 卫生 健康 委员会 提出 。 本 文件 由江 苏省 卫生 标准 化技术 委员 会归 口。 本 文件 主要 起草 单位 ： 江 苏省疾 病预 防控 制中 心 、 南京市 计量 监督 检测 院 、 苏州市 疾病 预防 控制 中 心、泰 州市 疾病 预防 控制 中
5、心、 苏州 锐讯 生物 科技 有限公 司、 北京 新羿 生物 科技有 限公 司 。 本 文件 主要 起草 人： 洪捷 、 林婧 、 蒋 云宇 、 周 恺、 周连 、 王慎 骄、 朱立 国 、 王尚君 、 范 宇宸 、 朱宝 立、王 雅琦 、李 家琛 、董 嘉、祝 令香 、王 楠 。 DB32/T 3762.16 2021 1 新型冠状 病毒检 测 技术规范 第16 部分： 核酸 数字 PCR 法 1 范围 本 文件 规定 了新 型冠 状病 毒 核酸 数字 PCR 检测 方法 。 本 文件 适用 于 新 冠病 例、 一般人群 和 重点 人群 的生 物样本 ， 包 括口 咽拭 子、 鼻咽拭 子、
6、血标 本 、 肛 拭子等 ，以 及其 他需 要检 测的样本 的 核算 数 字 PCR 检测。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求 DB 32/T 3762.3 新型 冠 状病毒 检测 技术 规范 第 3 部分： 核酸 荧 光 PCR 检测 程序 3 术语 和 定义 本文件 没有 界
7、定 的术 语和 定义 。 4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件 。 数字 PCR ： 数字 聚合 酶链 式反应 （digital polymerase chain reaction ） ORF1a/b ：开 放阅 读框 1a/b （open reading frame ） dNTPs ： 脱氧 核糖 核酸 三 磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate ） 人 RNase P 基因 ： 人核 糖 体核酸 酶基 因（Ribonuclease P ） 5 原理 一种对 核酸 分子 进行 绝对 定量的 实验 技术 ， 通 过将 一个样 本分 成几 十到 几万 份，
8、 分 配到 不同 的 反 应 单元 ， 每 个单 元至 少包 含 一个拷 贝的 目标 分子 。 在 每个反 应单 元中 分别 对目 标分子 进行 PCR 扩 增， 扩 增结束 后对 各个 反应 单元 的荧光 信号 进行 统计 学分 析，进 而计 算出 原始 样本 中目标 分子 浓度 。 目前数字 PCR 技 术 包 括芯 片 式 和 微 滴 式 两 种 ， 芯片 式 通 过 微 流 控 芯 片 实 现对 原 始 反 应 体 系 的 分 割， 该 方法 具有 稳定 性好 ， 均一 性好 的优 点， 但检 测成本 相对 较高 。 微 滴式 通过产 生微 小油 包 水 体 系 实 现体系 的分割 ，
9、该 方法有 反应速 度快， 检测 成本低 的优点 。为了 实现 对 新型 冠状病 毒 核酸 数字PCR 的定 量检测 ，本 标准 通过 数字PCR 的扩 增反 应直 接得 出新 冠病毒 ORF1a/b 基因 和 N 基因 的拷 贝数 。 6 基本要 求 6.1 实验室 资质 及级 别 DB32/T 3762.16 2021 2 检测工 作应 在BSL-2 级实验 室进行 。生 物安 全要 求遵 照 GB 19489 和 DB 32/T 3762.3 规 定执 行。 6.2 操作人 员资 质及 防护 实验过程 中 的个 人防 护遵照 GB 19489 第8条 和 DB 32/T 3762.3 规
10、 定执 行。 7 试剂与 材料 7.1 新冠病 毒核 酸提 取试 剂盒 ： 应当 选择 国家 药品 监督 管理部 门批 准的 试剂 ，建 议选择 磁珠 法、 膜吸 附法等 进行 核酸 提取 。 7.2 新冠病 毒数 字 PCR 预 混液 ： 含有 镁离 子，dNTPs 、RNA 酶 抑制 剂、 逆转 录酶 和 DNA 聚 合酶 等组 分的数字 PCR 预 混液 ，推 荐根据 不同 的数 字 PCR 方法和 仪器 选择 不同 的试 剂 。 7.3 引物序 列和 探针 ：检 测新 冠病 毒 ORF1a/b 基因和 N 基因的 引物 和探 针序 列见 表 1。 表1 新冠病 毒ORF1a/b 基因和
11、 N 基因 的引 物和 探针 序列 标靶 名称 序列 新型冠状病毒 ORF1ab 基因 上游引 物 CCCTGTGGGTTTTACACTTAA 下游引 物 ACGATTGTGCATCAGCTGA 探针 5-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3 新型冠状病毒N 基 因 上游引 物 GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT 下游引 物 CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG 探针 5-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3 8 仪器与 设备 8.1 生物安 全柜 。 8.2 生物安 全型 离心 机 。 8.3 涡旋振 荡
12、器 。 8.4 恒温 金 属浴 。 8.5 核酸提 取仪 。 8.6 数字 PCR 仪 。 9 操作步 骤 9.1 样本前 处理 DB32/T 3762.16 2021 3 按照DB 32/T 3762.3 中的 7.1 规 定执 行。 9.2 核酸提 取 按照DB 32/T 3762.3 中的 7.2 规 定执 行。 9.3 数字PCR 扩 增方 法 9.3.1 数字PCR 反 应体 系 数字PCR 仪 反应 体系 的总 体积根 据不 同厂 家 、 不 同 型号的 仪器 设备 需进 行相 应的调 整 ， 并 保持 各引 物探针 组分 终浓 度不 变。 9.3.2 数字PCR 反 应程 序 数
13、字PCR 反 应程 序如 表2， 不同方 法和 不同 仪器 设备 及试剂 反应 程序 可能 存在 差异， 需进 行调 整。 表2 数字 PCR 反 应程 序 步骤 温度 时间 循环数 1 50 60 min 1 cycle 2 95 10 min 1 cycle 3 95 30 s 40 cycles 55 1 min 4 98 10 min 1 cycle 5 4 5 min 1 cycle 9.3.3 对照数 字PCR 反 应的 设定 试验中应设置阳性对照 和阴性对照。用含 2019-nCoV ORF1ab 基 因 特 异 片 段 的 病 毒 样 颗 粒 、 含 2019-nCoV N 基
14、因 特异 片 段的病 毒样 颗粒 和含 人 RNase P 基因 特异 片段 的质 粒 作为 阳性 对照 。用 无核 酶水作 为阴 性对 照。 9.4 质量控 制与 结果 分析 9.4.1 质量控 制 以下 要 求其 中一 条不 符合 ，应重 新进 行试 验， 重新 进行 试 验应 从核 酸提 取开 始： a) 样本 人 RNase P 基因 有 荧 光信号 检出 ； b) 阴性对 照无 荧光 信号 ； c) 阳性对 照 两 个靶 标（ORF1ab 、N ） 荧光 信号 均 超 过 设定阈 值 。 9.4.2 阳性判 定 实 验室 确认 阳性 病例 需满 足以下 两个 条件 中的 一个 ： D
15、B32/T 3762.16 2021 4 a) 同一份 样本 中新 型冠 状病 毒 2 个 靶标 （ORF1ab 、 N ） 数字 PCR 检测 结果 均 100 copies/mL 。 如果出 现单 个靶 标 100 copies/mL 的检测结果 ， 则 需要重 新采 样 ， 重 新检测 。 如 果单靶标仍 100 copies/mL ，判定为 阳性 ； b) 同一病 例的 两种 不同 类型 样本数字 PCR 同 时出 现单 靶标 100 copies/mL ， 或同种类 型样本 两 次采样 检测 中均 出现 单个 靶标 100copies/mL 的检测结 果， 可判 定为 阳性 。 9.4.3 阴性判 定 在 质量 控制 符合 要求 的情况 下， 如果 样本 两个 靶标（ORF1ab 、N ） 没有 检测 出 荧光 信号 ，则 判定 为阴性 。
