1、I C S 1 1 . 2 2 0 C C S B 4 0 黑 龙 江 省 地 方 标 准 D B 2 3 / T 3 0 3 2 2 0 2 1 2 0 2 1 - 1 2 - 2 4 发 布 黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 2 0 2 2 - 0 1 - 2 3 实 施 DB23 规 模 化 奶 牛 场 牛 白 血 病 净 化 技 术 规 程D B 2 3 / T 3 0 3 8 2 0 2 1 前 言 本 文 件 按 照 G B / T 1 . 1 - 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则
2、的 规 定 起 草 。 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。 本 文 件 由 黑 龙 江 省 农 业 农 村 局 归 口 。 本 文 件 起 草 单 位 ： 黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 ， 东 北 农 业 大 学 。 本 文 件 主 要 起 草 人 ： 王 建 发 、 刘 云 、 武 瑞 、 连 帅 、 贺 显 晶 、 王 爽 、 宋 军 、 孙 东 波 、 周 玉 龙 、 王 海 、 胡 学 权 、 谢 颖 颖 。D B 2 3 / T 3 0 3 8 2 0 2 1 1 规 模 化 奶
3、 牛 场 牛 白 血 病 净 化 技 术 规 程 1 范 围 本 文 件 规 定 了 开 展 牛 白 血 病 净 化 的 技 术 规 程 。 本 文 件 适 用 于 规 模 化 奶 牛 场 实 施 针 对 牛 白 血 病 的 净 化 。 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 标 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 标 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的
4、 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 G B 1 6 5 6 8 奶 牛 场 卫 生 规 范 N Y / T 5 7 4 - 2 0 0 2 地 方 流 行 性 牛 白 血 病 琼 脂 凝 胶 免 疫 扩 散 试 验 方 法 中 国 动 物 疫 病 预 防 控 制 中 心 规 模 化 奶 牛 场 主 要 动 物 疫 病 净 化 技 术 指 南 3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。 3 . 1 牛 白 血 病 牛 白 血 病 是 由 牛 白 血 病 病 毒 引 起 的 一 种 以 淋 巴 细 胞 恶 性 增 生 ， 进 行 性 恶 病 质 变 化
5、 和 全 身 淋 巴 结 肿 大 为 特 征 的 一 种 慢 性 、 进 行 性 、 接 触 传 染 性 、 肿 瘤 性 疾 病 。 3 . 2 动 物 疫 病 净 化 在 一 个 养 殖 场 或 指 定 区 域 内 ， 通 过 持 续 监 测 和 检 测 发 现 患 病 动 物 或 带 毒 动 物 ， 并 通 过 淘 汰 带 毒 动 物 以 实 现 根 除 某 种 动 物 疫 病 的 过 程 。 4 检 测 规 程 4 . 1 琼 脂 凝 胶 免 疫 扩 散 试 验 使 用 一 次 性 无 菌 采 血 设 备 采 集 待 检 牛 只 血 液 ， 分 离 血 清 。 按 照 N Y / T 5
6、 7 4 - 2 0 0 2 检 测 血 清 中 牛 白 血 病 病 毒 g p 5 1 抗 原 ， 检 测 结 果 阳 性 即 判 定 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性 。 4 . 2 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 无 菌 采 集 待 检 牛 只 血 液 ， 分 离 血 清 或 血 浆 。 使 用 符 合 要 求 的 商 品 化 试 剂 盒 按 说 明 检 测 血 清 或 血 浆 中 牛 白 血 病 病 毒 g p 5 1 抗 原 或 牛 白 血 病 病 毒 X 2 抗 体 ， 检 测 结 果 阳 性 即 判 定 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性 。 无 菌 采 集 待
7、 检 泌 乳 牛 乳 汁 ， 使 用 符 合 要 求 的 商 品 化 试 剂 盒 按 说 明 检 测 乳 汁 中 牛 白 血 病 病 毒 抗 体 ， 检 测 结 果 阳 性 即 判 定 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性 。 4 . 3 基 因 扩 增 试 验 使 用 一 次 性 无 菌 采 血 设 备 采 集 待 检 牛 只 抗 凝 血 ， 使 用 商 品 化 全 血 基 因 组 D N A 提 取 试 剂 盒 按 说 明 提 取 全 血 中 的 D N A 。 核 酸 检 测 操 作 参 照 附 录 A 执 行 ， 被 检 测 样 品 P C R 扩 增 产 物 基 因 序 列 与
8、 牛 白 血 病 病 毒 囊 膜 基 因 序 列 同 源 性 在 9 5 % 以 上 ， 判 定 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性 。D B 2 3 / T 3 0 3 8 2 0 2 1 2 5 检 测 后 处 理 经 检 测 为 牛 白 血 病 病 毒 感 染 阳 性 牛 不 再 进 行 饲 养 ， 淘 汰 阳 性 牛 后 ， 使 用 次 氯 酸 钠 、 甲 醛 、 戊 二 醛 等 敏 感 消 毒 剂 对 牧 场 进 行 消 毒 ， 清 除 运 动 场 、 牛 舍 、 奶 厅 、 器 械 、 空 气 中 潜 在 的 病 毒 风 险 。 按 照 G B 1 6 5 4 8 严 格
9、执 行 卫 生 防 疫 制 度 ， 在 奶 牛 保 健 、 治 疗 、 护 理 时 ， 避 免 交 叉 感 染 。 6 持 续 检 测 与 净 化 启 动 净 化 程 序 后 ， 采 取 检 测 、 淘 汰 、 消 毒 相 结 合 的 净 化 措 施 对 奶 牛 场 牛 白 血 病 进 行 持 续 净 化 。 每 年 进 行 两 次 全 群 检 测 ， 发 现 阳 性 牛 的 处 置 方 式 同 5 。 7 净 化 标 准 与 维 持 按 照 规 模 化 奶 牛 场 主 要 动 物 疫 病 净 化 技 术 指 南 采 样 数 量 要 求 采 集 奶 牛 血 液 ， 连 续 2 年 牛 白 血
10、病 检 测 个 体 阳 性 率 小 于 0 . 1 % 可 列 为 假 定 阴 性 群 。 假 定 阴 性 群 无 需 再 进 行 全 群 检 测 ， 转 为 按 照 不 低 于 1 0 % 的 比 例 进 行 抽 样 检 测 ， 如 抽 样 检 测 不 符 合 个 体 阳 性 率 小 于 0 . 1 % 要 求 ， 则 按 照 4 6 推 荐 的 净 化 程 序 重 新 实 施 净 化 。D B 2 3 / T 3 0 3 8 2 0 2 1 3 附 录 A （ 规 范 性 附 录 ） 电 泳 法 检 测 牛 白 血 病 病 毒 囊 膜 基 因 核 酸 操 作 规 范 A . 1 引 物 序
11、 列 上 游 引 物 序 列 为 5 - C A A C C G A T C A T C A G A T G G G T A A G - 3 ， 下 游 引 物 序 列 为 5 - C A G G G A G C A T C T C C A A G T C T G - 3 。 A . 2 核 酸 扩 增 反 应 体 系 2 5 L 核 酸 扩 增 反 应 体 系 如 下 ： 双 蒸 水 1 8 . 3 L ， 待 测 D N A 样 品 1 . 0 L ， 上 游 引 物 0 . 5 L ， 下 游 引 物 0 . 5 L ， 耐 热 缓 冲 液 2 . 5 L ， 2 . 5 m m o l
12、 / L d N T P s 2 . 0 L ， 耐 热 D N A 聚 合 酶 0 . 2 L 。 A . 3 核 酸 扩 增 反 应 条 件 9 4 预 变 性 5 m i n ； 9 4 变 性 6 0 s ， 6 0 退 火 6 0 s , 7 2 延 伸 3 0 s ， 循 环 3 5 次 ； 7 2 延 伸 6 m i n 。 A . 4 电 泳 检 测 制 备 2 . 5 % 琼 脂 糖 凝 胶 板 。 在 电 泳 槽 中 加 入 电 泳 缓 冲 液 ， 使 液 面 刚 刚 没 过 凝 胶 。 取 5 . 0 L 扩 增 产 物 分 别 和 适 量 加 样 缓 冲 液 混 合 后 ， 加 到 凝 胶 孔 。 1 1 0 V 恒 压 电 泳 3 0 m i n ， 使 用 凝 胶 成 像 系 统 检 测 核 酸 扩 增 结 果 。 A . 5 判 定 标 准 被 检 测 样 品 P C R 扩 增 产 物 出 现 7 9 b p 特 异 性 目 的 条 带 ， 取 扩 增 产 物 进 行 测 序 ， 与 牛 白 血 病 病 毒 囊 膜 基 因 序 列 同 源 性 在 9 5 % 以 上 ， 判 定 该 牛 患 有 牛 白 血 病 。
