1、DB23 黑 龙 江 省 地 方 标 准 2 0 2 1 - 1 2 - 2 4 发 布 2 0 2 2 - 0 1 - 2 3 实 施 D B 2 3 / T 3 0 3 9 2 0 2 1 黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 灵 芝 液 体 菌 种 制 备 技 术 规 程 I C S 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 0 5D B 2 3 / T 3 0 3 9 2 0 2 1 I 前 言 本 文 件 按 照 G B / T 1 . 1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的
2、规 定 起 草 。 请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。 本 文 件 由 黑 龙 江 省 林 业 和 草 原 局 提 出 。 本 文 件 起 草 单 位 ： 尚 志 市 远 成 菌 业 有 限 公 司 、 东 北 林 业 大 学 、 哈 尔 滨 学 院 、 黑 龙 江 省 尚 志 国 有 林 场 管 理 局 老 街 基 林 场 、 黑 龙 江 省 尚 志 国 有 林 场 管 理 局 、 黑 龙 江 省 林 业 和 草 原 局 调 查 规 划 设 计 院 。 本 文 件 主 要 起 草
3、人 ： 邹 莉 、 许 泽 成 、 孙 婷 婷 、 韩 金 胜 、 蔡 晓 楼 、 王 旭 彤 、 耿 楠 楠 、 孙 健 、 刘 传 龙 、 曲 晓 磊 、 李 亚 伟 、 乌 木 提 巴 合 提 别 克 、 佟 鑫 宇 。D B 2 3 / T 3 0 3 9 2 0 2 1 1 灵 芝 液 体 菌 种 制 备 技 术 规 程 1 范 围 本 文 件 规 定 了 灵 芝 （ G a n o d e r m a l u c i d u m ） 液 体 菌 种 制 备 的 环 境 卫 生 要 求 、 生 产 仪 器 和 设 备 、 菌 种 选 择 、 制 备 母 种 、 制 备 摇 瓶 液 体
4、 种 、 液 体 种 发 酵 罐 空 消 、 制 备 发 酵 罐 液 体 种 培 养 基 、 发 酵 罐 液 体 种 的 接 种 、 发 酵 罐 液 体 种 培 养 条 件 、 发 酵 罐 液 体 种 检 测 、 发 酵 罐 液 体 种 质 量 要 求 、 生 产 档 案 。 本 文 件 适 用 于 灵 芝 液 体 菌 种 制 备 。 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文
5、 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 G B / T 1 5 0 . 1 压 力 容 器 第 1 部 分 ： 通 用 要 求 G B / T 1 9 2 1 工 业 蒸 汽 锅 炉 参 数 系 列 G B 5 7 4 9 生 活 饮 用 水 卫 生 标 准 G B / T 1 1 1 6 5 实 验 室 p H 计 G B / T 1 3 5 5 4 高 效 空 气 过 滤 器 G B 1 9 1 5 3 容 积 式 空 气 压 缩 机 能 效 限 定 值 及 能 效 等 级 G B 5 0 0
6、 7 3 洁 净 厂 房 设 计 规 范 N Y / T 5 2 8 食 用 菌 菌 种 生 产 技 术 规 程 3 术 语 和 定 义 本 文 件 没 有 需 要 界 定 的 术 语 和 定 义 。 4 环 境 卫 生 要 求 4 . 1 生 产 环 境 应 符 合 N Y / T 5 2 8 的 规 定 。 4 . 2 生 产 车 间 应 符 合 G B 5 0 0 7 3 的 规 定 。 5 生 产 仪 器 和 设 备 液 体 种 发 酵 罐 应 符 合 G B / T 1 5 0 . 1 的 规 定 ， 空 气 压 缩 机 应 符 合 G B 1 9 1 5 3 的 规 定 ， 空 气
7、 过 滤 器 应 符 合 G B / T 1 3 5 5 4 的 规 定 ， p H 计 应 符 合 G B / T 1 1 1 6 5 的 规 定 ， 蒸 汽 锅 炉 应 符 合 G B / T 1 9 2 1 的 规 定 ， 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 、 超 净 工 作 台 、 恒 温 培 养 箱 、 恒 温 振 荡 培 养 箱 、 液 体 菌 种 接 种 枪 、 冰 箱 、 显 微 镜 、 磅 秤 、 天 平 应 符 合 N Y / T 5 2 8 的 规 定 。D B 2 3 / T 3 0 3 9 2 0 2 1 2 6 菌 种 选 择 选 择 抗 逆 性 强 、 抗 杂 菌 能
8、力 强 、 菌 丝 生 长 健 壮 、 产 量 高 的 菌 种 。 7 制 备 母 种 7 . 1 母 种 培 养 基 的 制 作 制 作 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 （ P D A ） 或 综 合 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 （ C P D A ） ， 装 入 试 管 （ 1 8 m m 1 8 0 m m 或 2 0 m m 2 0 0 m m ） 中 ， 分 装 量 宜 为 试 管 长 度 的 1 / 4 ， 塞 上 棉 塞 ， 棉 塞 应 使 用 梳 棉 。 将 试 管 放 入 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 中 ， 在 0 . 1 0 5 M p a 0
9、. 1 2 5 M p a 下 灭 菌 3 0 m i n 。 灭 菌 后 摆 放 成 的 斜 面 培 养 基 顶 端 应 距 棉 塞 底 部 2 0 m m 。 7 . 2 接 种 与 培 养 在 无 菌 条 件 下 ， 用 接 种 钩 取 黄 豆 粒 大 小 的 初 始 菌 种 接 种 在 母 种 培 养 基 上 。 母 种 培 养 的 温 度 宜 为 2 8 1 ， 空 气 相 对 湿 度 控 制 在 4 0 % 5 0 % ， 通 风 、 避 光 培 养 1 4 d 1 8 d 。 8 制 备 摇 瓶 液 体 种 8 . 1 培 养 基 配 方 培 养 基 配 方 ： 葡 萄 糖 2
10、0 g 、 玉 米 粉 1 0 g 、 酵 母 粉 5 g 、 蛋 白 胨 3 g 、 磷 酸 二 氢 钾 2 g 、 硫 酸 镁 1 g 、 水 1 0 0 0 m L 。 水 的 质 量 应 符 合 G B 5 7 4 9 的 规 定 。 8 . 2 培 养 基 的 制 作 、 灭 菌 将 配 方 中 的 原 料 充 分 混 合 均 匀 ， 装 入 5 0 0 m L 或 1 0 0 0 m L 、 耐 1 2 6 高 温 、 无 色 或 近 无 色 的 玻 璃 三 角 瓶 中 ， 装 液 量 宜 为 三 角 瓶 体 积 的 1 / 4 ， 用 1 6 c m 1 6 c m 聚 乙 烯
11、透 气 封 瓶 膜 封 口 。 在 0 . 1 0 5 M p a 0 . 1 2 5 M p a 下 灭 菌 3 0 m i n 。 8 . 3 摇 瓶 液 体 种 的 制 备 在 无 菌 条 件 下 ， 用 接 种 铲 将 一 管 母 种 接 入 摇 瓶 液 体 种 培 养 基 中 ， 置 于 恒 温 振 荡 培 养 箱 ， 在 2 8 以 1 8 0 r / m i n 振 荡 培 养 9 d 1 2 d 。 当 培 养 液 澄 清 透 明 ， 菌 丝 球 密 集 均 匀 悬 浮 于 液 体 中 不 分 层 ， 即 可 获 得 摇 瓶 液 体 种 。 9 液 体 种 发 酵 罐 空 消
12、液 体 种 发 酵 罐 初 次 使 用 ， 应 检 查 发 酵 罐 上 全 部 阀 门 和 压 力 表 ， 进 行 空 消 。 空 消 时 罐 内 蒸 汽 压 力 应 达 到 0 . 1 0 5 M p a 0 . 1 2 5 M p a 、 温 度 应 达 到 1 2 1 1 2 4 灭 菌 4 0 m i n 。 1 0 制 备 发 酵 罐 液 体 种 培 养 基 1 0 . 1 培 养 基 配 方 在 8 . 1 配 方 的 基 础 上 加 入 2 . 9 m L / L 的 消 泡 油 。 1 0 . 2 初 始 p H 值 1 m o l / L H C l 或 1 m o l /
13、L N a O H 调 节 p H 值 为 5 . 5 6 . 0 。D B 2 3 / T 3 0 3 9 2 0 2 1 3 1 0 . 3 投 料 与 定 容 将 1 0 . 1 中 的 原 料 按 比 例 充 分 混 合 均 匀 ， 倒 入 液 体 种 发 酵 罐 中 ， 加 水 定 容 至 罐 体 总 容 积 的 6 5 % 7 0 % ， 拧 紧 上 料 口 盖 。 1 0 . 4 灭 菌 液 体 种 发 酵 罐 内 蒸 汽 压 力 应 达 到 0 . 1 0 5 M p a 0 . 1 2 5 M p a ， 温 度 应 达 到 1 2 1 1 2 4 灭 菌 4 0 m i n
14、 。 1 0 . 5 冷 却 灭 菌 后 将 冷 水 通 入 发 酵 罐 夹 层 或 者 内 置 冷 却 系 统 中 循 环 ， 使 培 养 基 降 温 至 2 4 2 8 。 降 温 过 程 中 应 及 时 向 发 酵 罐 内 通 入 无 菌 风 。 1 1 发 酵 罐 液 体 种 的 接 种 用 带 有 手 柄 的 内 径 略 大 于 接 种 口 的 铁 丝 圈 缠 绕 纱 布 ， 蘸 上 9 5 % 的 酒 精 ， 套 在 接 种 口 上 点 燃 。 打 开 摇 瓶 液 体 种 封 瓶 膜 ， 用 火 焰 灼 烧 瓶 口 3 0 s 4 0 s ， 打 开 接 种 口 盖 ， 将 摇 瓶
15、 液 体 种 迅 速 倒 入 罐 中 ， 接 种 量 为 发 酵 罐 装 液 量 体 积 的 8 % 。 迅 速 盖 好 接 种 口 ， 拧 紧 。 1 2 发 酵 罐 液 体 种 培 养 条 件 1 2 . 1 通 风 量 每 分 钟 宜 通 入 无 菌 空 气 1 . 2 5 m 3 。 1 2 . 2 罐 压 应 保 持 在 0 . 0 3 M p a 0 . 0 5 M p a 。 1 2 . 3 培 养 温 度 宜 控 制 在 2 8 1 。 1 2 . 4 培 养 时 间 宜 控 制 在 8 d 1 0 d 。 1 3 发 酵 罐 液 体 种 检 测 1 3 . 1 取 样 接 种
16、 4 d 后 进 行 检 测 ， 用 酒 精 火 焰 灼 烧 取 样 阀 3 0 s 4 0 s ， 弃 掉 最 初 流 出 的 少 量 液 体 种 ， 取 3 0 m L 5 0 m L 液 体 种 放 入 无 菌 1 5 0 m L 三 角 瓶 中 ， 塞 紧 棉 塞 。 取 样 后 应 用 酒 精 火 焰 把 取 样 阀 烧 干 。 1 3 . 2 检 测 对 1 3 . 1 所 取 样 品 在 P D A 平 板 培 养 基 上 画 线 培 养 ， 在 2 8 1 下 培 养 2 d 3 d ， 每 天 观 察 菌 落 生 长 情 况 ， 若 P D A 平 板 培 养 基 上 灵 芝
17、 菌 丝 正 常 生 长 ， 没 有 杂 菌 污 染 ， 则 表 明 菌 种 合 格 。 1 4 发 酵 罐 液 体 种 质 量 要 求 1 4 . 1 感 官 指 标 应 符 合 表 1 的 要 求 。D B 2 3 / T 3 0 3 9 2 0 2 1 4 表 1 感 官 指 标 项 目 指 标 菌液色泽 球状菌丝体呈乳白色，滤液呈黄棕色 菌液形态 菌液稍粘稠，有大量球状菌丝体悬浮、分布均匀、不迅速分层 菌液气味 有灵芝菌种培养时特有的香味，无异味，发酵罐排气口气味正常 1 4 . 2 理 化 指 标 应 符 合 表 2 的 要 求 。 表 2 理 化 指 标 项 目 指 标 p H 值
18、 3 . 5 5 . 5 菌丝湿重（ g 1 0 0 m L ） 5 显微镜下菌丝形态 菌丝粗壮，有球状和丛状菌丝，分布均匀 样品无菌检查 有灵芝菌丝生长，无霉菌、酵母菌、细菌菌落生长 1 5 生 产 档 案 应 建 立 生 产 档 案 ， 内 容 包 括 ： 环 境 卫 生 要 求 、 生 产 仪 器 和 设 备 、 菌 种 选 择 、 制 备 母 种 、 制 备 摇 瓶 液 体 种 、 液 体 种 发 酵 罐 空 消 、 制 备 发 酵 罐 液 体 种 培 养 基 、 发 酵 罐 液 体 种 的 接 种 、 发 酵 罐 液 体 种 培 养 条 件 、 发 酵 罐 液 体 种 检 测 、 发 酵 罐 液 体 种 质 量 要 求 。 _
