1、 ICS 65.150 CCS B 52 22 吉林省地方标准 DB 22/T 3298 2021 淡水鱼肠 道常见致 病菌分离 与纯化 技术规程 Technical code of practice on isolation and purification of common pathogenic bacteria of intestinal bacteria for freshwater fish 2021 - 11 - 26 发布 2021 - 12 - 15 实施 吉林省市 场监督 管 理厅 发 布 DB 22/T 3298 2021 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 202
2、0 标 准化 工作 导则 第1 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定 起草。 请注意 本文 件中 的某 些内 容可能 涉及 专利 。本 文件 的发布 机构 不承 担识 别专 利的责 任。 本文件 由吉 林省 农业 农村 厅提出 并归 口。 本文件 起草 主要 单位 ：吉 林农业 大学 、通 化师 范学 院、吉 林省 水产 技术 推广 总站。 本文件 主要 起草 人： 张东 鸣、陈 玉珂 、王 秋举 、郭 志欣、 蔺丽 丽、 刘洪 健 、 赵云龙 、吴 振超 。 DB 22/T 3298 2021 1 淡 水鱼肠 道常见致 病菌分 离与纯化 技术规 程 1 范围 本文件 规定
3、 了淡 水鱼 肠道 常见致 病菌 分离 与纯 化的 实验器 具 、 试 剂和 培养 基 、 准备工 作 、 分 离纯 化 和记录 等。 本文件 适用 于淡 水鱼 肠道 常见致 病菌 的分 离与 纯化 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB 4789.28 食 品微 生物 学检验 培 养基 和试 剂的 质 量要求 SN/T 2
4、632 2010 微生 物 菌种常 规保 藏技 术规 程 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。 肠道致 病菌 intestinal pathogenic bacteria 存在于 鱼类 肠道 中可 以导 致鱼类 发生 疾病 的细 菌。 注： 淡 水 鱼 肠 道 中 常 见 的 致 病 菌 有 ： 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus ） 、 嗜 水 气 单 胞 菌 （Aeromonas hydrophila ） 、 大肠杆菌 （Escherichia coli ） 、 维氏气单胞菌 （Aeromonas veronii ） 、 爱德华氏菌
5、 （Edwardsiella ） 和温和气单胞菌（Aeromonas sobria ）等。 4 实验器 具 超净工 作台 、显 微镜 （10 倍 100 倍） 、解 剖镜 、离心 机（RCF 10 000 g 30 000 g ）、 高压蒸 汽灭 菌锅 （ 灭菌 压 力 0 kg/cm 2 3 kg/cm 2 ） 、 医 用 冰 箱 （4 80 ） 、 电 子分 析天 平 （ 相 对精度 1/1000 ） 、 生化 培 养箱 （ 具备 制冷 功能） 、pH 计、 匀 浆器、 恒温 振荡 器 （往复 式） 、 移 液器 （100 mL 和1000 mL ） 、 漩涡 混匀 器 （ 圆周 震动 ）
6、 、 酒精 灯、 金属接 种环 、 玻璃 涂布 棒 、 无 菌培 养皿 （直 径 90 mm）、 玻璃 试管 （25 mL ）。 5 试剂和 培养 基 试剂 试剂为 75 % 乙 醇，0.7 % 生理 盐水 ，试 剂均 为分 析 纯。 DB 22/T 3298 2021 2 培养基 固体和 液体 培养 基按 表 1 执行。 琼脂 仅在 制作 LB 固体培 养基 时添 加， 培养 基质量 要求 符合 GB 4789.28 的 规定 。 表1 LB 培 养基 序号 成分 用量 1 胰蛋白 胨 10.0 g 2 酵母提 取物 5.0 g 3 氯化钠 10.0 g 4 琼脂 15.0 g 5 蒸馏水
7、1000 mL 6 准备工 作 器具消 毒 将剪刀 、 镊 子、 解 剖刀、 培养皿 、 玻 璃试 管和 锥形 瓶等器 具采 用高 压蒸 汽灭 菌锅高 压 （121 ） 灭 菌 20 min 。 制备平 板 6.2.1 培养基 灭菌 将 LB 培养 基置 于锥 形瓶 中经高 压蒸 汽灭 菌( 121 灭菌 20 min) 后放 置于 提前灭 菌的 无菌 操 作 台中， 待培 养基 温度 不烫 手且未 凝固 时开 始倒 制平 板。 6.2.2 倒制平 板 6.2.2.1 一只手 拿锥形 瓶， 靠近酒 精灯火 焰，另 一只 手拔出 棉塞； 使锥形 瓶瓶 口迅速 通过火 焰， 此 步 骤重复 2 次
8、 3 次。 6.2.2.2 将培养 皿打 开一 条稍 大于 瓶口的 缝隙 ，轻 轻倒 入厚 度为 3 mm 5 mm LB 培养基 ，将 培 养 皿上盖 半掩 放置 。 6.2.2.3 整个倒 制平 板过 程均 在超 净工作 台中 进行 。 6.2.3 平板冷 却 待培养 皿中 培养 基温 度降 至室温 后， 盖上 盖子 ，备 用。 7 分离纯 化 流程图 DB 22/T 3298 2021 3 分离和 纯化 步骤 见图 1。 取样 （ 见 7.2） 制备悬液 （ 见 7.3） 接种 （ 见 7.4） 培养 （ 见 7.5） 纯化 （ 见 7.6） 检验纯度 （ 见 7.7） 保种 （ 见 7
9、.8） 记录（ 见 8） 图1 分离与 纯化 步骤 取样 选取具 有典 型症 状的 濒死 病鱼作 为分 离肠 道致 病菌 的对象 。用 75 % 的酒 精 棉球对 鱼体 体表 消 毒 后，打 开腹 腔， 再用 75 % 酒精棉 球擦 拭肠 管外 壁， 将整个 肠道 取出 ，分 离前 肠、中 肠和 后肠 ， 备 用 。 制备悬 液 7.3.1 用约 2 倍 肠道 内容 物体 积 的无菌 生理 盐水 将肠 道内 容物冲 入无 菌离 心管 中， 制成细 菌悬 液。 7.3.2 将 7.3.1 的细 菌悬 液在 无 菌条件 下涂 布在 LB 培 养 基上 28 37 培养 24 h， 观察 菌 落的生
10、 长情 况。 7.3.3 根据 7.3.2 的 实验 结果 ， 在无菌 条件 下采 用无 菌的 生理盐 水将 7.3.1 的细 菌 悬液稀 释成 不同 倍数的 稀释 菌液 。建 议稀 释倍数 为：10 -3 、10 -4 和 10 -5 。 接种 分别取 7.3.3 的 稀释 菌 液 0.1 mL ， 在酒 精灯 外 焰附近 采用 灭菌 的涂 布棒 将菌液 均匀 涂布 在 LB 培养基 上， 至液 体全 部被 培养基 吸收,每 个浓 度的 菌 液做 3 个 重复 。 DB 22/T 3298 2021 4 培养 在培养 皿上 盖表 面标 注样 品名称 、日 期和 采样 地等 信息。 置于 恒温
11、 培养 箱中 28 37 倒 置培养 24 h 。 纯化 7.6.1 划线分 离 在无菌 条件下 ，采 用接种 环挑取 同一培 养皿 中不同 颜色和 不同形 态的 单个菌 落在无 菌 LB 培养基 表面进 行连 续划 线分 离 。 在 培养皿 上盖 表面 做好 标注 ， 置于恒 温培 养箱 中 28 37 培养 24 h 。 7.6.2 纯化时 机 重复 7.6.1 操作 2 3 次。待 培养 基上 均匀 的长 出颜色 和形 态相 同的 单个 菌落时 便可 以进 行 细 菌的纯 化培 养。 7.6.3 纯化培 养 采用无 菌的接 种环 将挑取 的单个 菌落接 种于 装有 无 菌的 LB 液 体
12、培 养基试 管 中，在 试管上 标注 样 品名 称、日期和采 样地等信息 ，然后将试管 置于恒温振 荡器中 ，在温 度 28 37 ，转速每分钟 120 转 的条 件下 ，培养 16 h 18 h 。 检验纯 度 培养结 束后 按照 7.4 和 7.5 的方 法再 进行 分离 培 养，若 新平 板中 长出 不同 颜色或 不同 形态 的菌 落，则 需继 续纯 化， 直至 平板上 长出 相同 的单 一菌 落。 保种 按照 SN/T 2632 2010 中 附录 D 规 定执 行。 8 记录 记录内 容 记录内 容详 见表 2 。 表2 细菌 分离 与纯 化记 录 例次 品种 鱼体特 征 取样地 点 取样时 间 取样部 位 菌液浓 度 获得菌 株数 量 1 2 3 DB 22/T 3298 2021 5 存档 及时将 记录 归档 ，保 存。
