1、 ICS 65.020 CCS B 05 22 吉 林省地方标准 DB22/T 3289 2021 玉木耳液 体菌种生 产技术规 程 A code of practice for liquid spawn production of white wood ear 2021 - 11 - 26 发布 2021 - 12 - 15 实施 吉林省市 场监督 管 理厅 发 布 DB22/T 3289 2021 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标准 化工 作导则 第1 部分： 标准化 文件 的结构 和起草 规则 的规 定 起草。 请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。 本
2、文 件的 发布机 构不 承担 识别 这些 专利的 责任 。 本文件 由吉 林省 农业 农村 厅提出 并归 口。 本文件 起草 单位 ：吉 林农 业大学 、黑 龙江 黑臻 生物 科技有 限公 司。 本文件 主要 起草 人： 李晓 、张波 、徐 安然 、钱 可晴 、杨迪 、刘 宗、Samwel 、 马世玉 。 DB22/T 3289 2021 1 玉 木耳液 体菌种生 产技术 规程 1 范围 本文件 确立 了玉 木耳 液体 菌种生 产的 程序 ， 规定 了 玉木耳 液体 菌种 生产 条件 、 生 产技 术 、 贮 存和 记 录与档 案。 描述 了生 产记 录等追 溯方 法。 本文件 适用 于玉 木
3、耳 液体 菌种的 生产 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB/T 150.4 压 力容 器 第 四部分 ：制 造、 检验 和验 收 GB 4789.28 食 品安 全国 家标准 食 品微 生物 学检 验 培养 基和 试剂 的质 量要 求 GB 5749 生活 饮用 水卫 生 标准 GB/T 12728-2006 食用 菌
4、术语 GB 50073 洁净 厂房 设计 规范 NY/T 391 绿色 食品 产 地 环境质 量 NY/T 528 食用 菌菌 种生 产技术 规程 NY/T 1846 食 用菌 菌种 检 验规程 DB22/T 2603 玉木 耳菌 种 3 术语和 定义 GB/T 12728 界 定的 以及 下 列术语 和定 义适 用于 本文 件。 3.1 玉木耳 white wood ear 由吉林 省农 作物 品种 审定 委员会 审定 的毛 木耳 （Auricularia cornea ） 的白 色 变异新 品种 （吉 菌登 2016002）。 3.2 液体菌 种 liquid spawn 培养基 为液 体
5、状 态的 菌种 。 来源 ：GB/T 12728 2006 ，2.5.30 。 3.3 液体菌 种发 酵罐 cultivation apparatus for liquid spawn 食用菌 液体 菌种 培养 专用 设备， 要求 不锈 钢材 质， 并符合 GB/T 150.4 的要 求。 3.4 接种量 inoculation rate DB22/T 3289 2021 2 接入发 酵罐 中的 食用 菌菌 种数量 ，用 菌种 体积 与培 养基体 积的 百分 比表 示。 3.5 发酵罐 空消 empty fermenter cultivation apparatus 对尚未 加水 投料 的空
6、发酵 罐进行 高压 蒸汽 灭菌 。 3.6 发酵罐 实消 full fermenter cultivation apparatus 对投料 后的 发酵 罐进 行高 压蒸汽 灭菌 。 4 生产流 程 玉木耳 液体 菌种 生产 流程 见图 1 。 图1 液 体菌 种生 产流 程图 5 生产要 求 生产条 件 5.1 5.1.1 人员要 求 从事液 体菌 种生 产的 各级 操作人 员应 具有 食用 菌菌 种生产 或检 验人 员从 业资 格证方 可上 岗。 5.1.2 环境卫 生 5.1.2.1 场地地 势平坦 且干 燥、空 气优良 、通风 好， 排水顺 畅，交 通便利 ，水 源电源 充足， 水质 应
7、 符 合 GB 5749 要 求。 5.1.2.2 附近 3000 m 无废 水、废 气、废 渣、粉 尘、 烟尘和 垃圾场 、畜禽 场等 污染源 ，环境 卫生 指 标 应符合 NY/T 391 的 规定 。 5.1.3 生产车 间 DB22/T 3289 2021 3 地面防 水、防 腐蚀 、防渗 漏、防 滑、易 清洗 ，应有 1.01.5 的排 水坡 度 和排水 系统， 排水 沟 应是圆 弧式 的明 沟； 墙壁 和天花 板能 防潮 、防 霉、 防水、 易清 洗。 5.1.4 接种车 间 应按照 GB 50073 规 定执 行。 5.1.5 液体菌 种生 产车 间 5.1.5.1 水、电 （停
8、 电需 配备 发电 机）、 蒸汽 、空 气循 环四 大系统 配备 完善 保证 生产 需求。 5.1.5.2 液体菌 种生 产车 间应 按照 GB 50073 规定 执行 。 5.1.6 生产设 施 液体菌 种生 产车 间设 置菌 种配制 室、 灭菌 室、 无菌 接种室 、 恒 温培 养室 、 发 酵液配 料室 、 发 酵 罐 培 养室、 化验 室和 菌种 保藏 室，且 布局 合理 ，规 模配 套。其 中部 分场 所应 达到 如下要 求： a) 摇瓶培 养室 和发 酵罐 培养 室应配 备调 温设 施， 空间 洁净度 达到 十万 级； b) 无菌接 种室 洁净 度达 到万 级，接 种机 位置 空气
9、 洁净 度达到 百级 ； c) 化验室 和菌 种保 藏室 有相 应实验 检测 设备 和灭 菌设 施及 常 规用 具。 5.1.7 生产设 备 包括发 酵罐 、 液 体菌 种接 种器、 高压 蒸汽 灭菌 锅、 备用发 电设 备、 调温 设备 、 除湿 设备、 百级 净化 系统、 层流 罩、 超净 工作 台、 恒 温摇 床、 恒温 培养 箱、 冰 箱、 普通 光学 显微 镜、 磁 力搅 拌器 、 大 量 程 电 子称、 电子 天平 、pH 计等。 5.1.8 培养原 料 所用原 料应 符合 NY/T 528 的要 求， 生物 制剂 和天 然 材料的 水不 溶性 固体 物料 应小于 40 目。 5.
10、1.9 生产品 种 选用优 质、 高产、 稳定、 抗逆性 强、 商品 性好 的玉 木耳品 种， 从具 备相 应资 质的单 位引 种， 使用 经 省级以 上农 作物 品种 审定 委员会 审（ 认） 定或 登记 （备案 ）的 品种 ，并 符合 DB22/T 2603 的 要求 。 生产技 术 5.2 5.2.1 母种制 备 使用母 种固 体培 养基 ，配 方参见 附录 A.1 ，生 产应 符合 NY/T 528 的要 求。 5.2.2 摇瓶菌 种制 备 5.2.2.1 培养基 配方 配方按 照附 录 A.2 。 5.2.2.2 培养基 制备 选无青 皮、 未发 芽的 新鲜 马铃薯 200 g ，
11、洗 净、 去皮 、 去芽 眼， 切 成块 状， 加 水文火 煮沸 15 min ， 用 4 层湿 纱布 过滤 得滤 液 ，再加 入其 余原 料至 溶解 ，定容 至 1000 mL 。 DB22/T 3289 2021 4 5.2.2.3 分装 使用 500 mL 1000 mL 、耐 121 高 温的 无色玻 璃三角 瓶，装 液量 为三角 瓶容积 的 1/3 3/5 ， 在三角 瓶中 放入 两粒 转子 ，使用 棉塞 封瓶 口， 棉塞 外加盖 四层 纱布 ，灭 菌时 棉塞外 加盖 牛皮 纸防 潮。 5.2.2.4 高压灭 菌 将分装 好的 三角 瓶放 入高 压蒸汽 灭菌 锅内 进行 高压 灭菌
12、，121 灭菌 30 min 。 灭 菌完 毕后 自然 降 压待温 度降 至 70 以 下 ，打开 灭菌 锅将 装有 液体 培养基 的三 角瓶 取出 放入 接种室 。 5.2.2.5 冷却接 种 三角瓶 液体 培养 基自 然冷 却至 20 25 时接 种。 在 无菌 条件 下， 使用 经 火焰灼 烧灭 菌并 冷 却 的接种 针挑取 8 块 10 块（23）mm （23 ）mm 母种 菌块 迅速 转接于 待 接种摇 瓶培养 基内 ，封 瓶口， 接种 完成 后贴 好标 签。 5.2.2.6 恒温培 养 具体操 作与 要求 如下 ： a) 培养室 消毒 ：培 养室 使用 前 2 d 采用 臭氧 发生
13、 器消 毒，并 用 5% 的 新洁 尔灭 溶液或 75% 酒精 擦拭消 毒恒 温培 养箱 和恒 温振荡 摇床 ； b) 培养条 件： 将三 角瓶 放 入 25 恒温 箱中 静置 培养 1 d， 然后 置于 磁力 搅拌 器 或恒温 摇床 上 培养， 温度 控制 在 25 1 ， 转速 140 rpm 160 rpm ， 培养 时间 7 d 9 d。 5.2.2.7 菌种标 准检 验 具体操 作与 要求 如下 ： a) 菌丝形 态 ：静 止 10 min 后 观察 ，菌 球下 沉（ 占 90% 以上 ）且 呈白 色， 上清 液 澄清透 明 ，表 面 无或有 少量 泡沫 ，菌 球颗 粒大小 均匀 一
14、致 ，菌 球表 面菌丝 呈刺 球状 ； b) 酸碱度 ：pH 值在 5.0 5.5 之间 ； c) 镜检： 平皿 显微 镜下 观察 无杂菌 。 5.2.3 发酵罐 液体 菌种 制备 5.2.3.1 发酵罐 检查 及发 酵罐 空消 具体操 作与 要求 如下 ： a) 检查液 体菌 种发 酵罐 上全 部阀门 及压 力表 ，要 求无 损坏并 能正 常工 作； b) 清洗待 用发 酵罐 内壁 、用 水冲洗 安全 阀、 压力 表、 罐盖， 确保 无杂 物、 无菌 皮； c) 发 酵 罐初 次 使用 、出 现 杂菌 、 长期 放 置或 更换 品 种等 情 况出 现 其一 时应 进 行发 酵 罐空 消，空
15、消要求 蒸汽 压力 0.12 MPa 、温度 为 121 、 灭菌 40 min 。 5.2.3.2 液体培 养基 制备 按照附 录 A.3 配方 称取 原 料，原 料应 符合 GB 4789.28 中 的规 定 ， 用水 符合 GB 5749 中的 要求 。 5.2.3.3 投料定 容 DB22/T 3289 2021 5 使用漏 斗通 过上 料口 将原 料加入 罐体 ， 装液 量为 罐 体容量 的 60% 70% ， 加入 0.03% 消 泡剂 ， 通入 空气搅 拌 1 min 2 min 混 合均匀 ，将 液体 菌种 发酵 罐口擦 干后 盖上 罐盖 ，拧 紧螺丝 ，再 次检 查发 酵 罐
16、 各部位 安装 是否 合格 。 5.2.3.4 发酵罐 实消 打开蒸 汽阀 门给 发酵 罐通 蒸汽， 当温 度到 达 90 时关闭 空气 压缩 机， 继续 加热使 发酵 罐 温 度 达 到 121 保持 80 min ，温 度不应 低于 121 。 5.2.3.5 冷却和 调压 实消结 束后 关闭 蒸汽 阀门 停止加 热， 开启 冷水 阀门 开 始降温 ， 当 温度 降至 110 、 压 力降 至接 近 0 Mpa 时 ，打 开空 气压 缩机 开关， 给发 酵罐 通入 无菌 空气， 当温 度降 至 25 时关闭 冷却 水。 5.2.3.6 接种 具体操 作步 骤与 要求 如下 ： a) 接种前
17、 ，接 种人 员清 洗双 手，然 后再 用 75% 酒精 消 毒； b) 关闭通 风系 统， 接种 结束 后再开 启； c) 调整发 酵罐 微量 进气 ，保 持正压 ； d) 用酒精 棉擦 拭接 种口 附近 ，并用 酒精 喷灯 消毒 ； e) 接 种 口 周 围 放 置 酒 精 棉 并 点 燃 ， 关 闭 排 气 阀 ， 打 开 接 种 口 ， 拿 取 摇 瓶 菌 种 在 火 焰 上 方 拔 掉瓶塞 ，灼 烧瓶 口 10 s 13 s 后将 菌种 倒入 发酵 罐 中，接 种量 为 1:1000 ； f) 灼烧接 种口 盖子 8 s 10 s 后盖 好接 种口 ； g) 打开排 气阀 ，调 整进
18、 气量 。 5.2.3.7 培养 具体操 作与 要求 如下 ： a) 罐内换 气量 1: 0.4 V/V 1.2 V/V （料 液体 积/空 气体 积）， 即接 种完 毕 1 d 2 d 微量 进 气 ， 3 d 后 逐渐 加大 进气 量，5 d 6 d 后 大进 气量 进气 ，6 d 7 d 进 气速 度不 变 ； b) 温度始 终控 制在 25 2 ； c) 罐内压 保持 在 0.05 MPa 。 5.2.4 罐内液 体菌 种纯 度检 测 发酵罐 液体菌 种培 养至 48 h72 h ，应 对罐 内菌种 进行一 次杂菌 检测 ，具体 检测内 容及要 求见 附 录 B 。 5.2.5 罐内液
19、 体菌 种质 量检 测 8 d 后 达到 放罐 质量 标准 即可放 罐, 发酵 罐液 体菌 种质量 标准 参见 附录 C。 终止发 酵后 ， 罐内 外 温 度均保 持在 25 2 ，应在 4 h 内 完成 接种 。 5.2.6 放罐接 种 放罐接 种应 按下 列步 骤进 行： a) 连接接 种管 道， 通蒸 汽消 毒 30 min ，待 管道 冷却 后 连接至 菌种 罐； DB22/T 3289 2021 6 b) 调整菌 种罐 压力 稳定 后打 开阀门 送菌 种， 开始 接种 ，接种 量为 25 mL 30 mL ； c) 接种结 束后 关闭 阀门 ， 将 接种管 道接 在供 水管 上 ，
20、冲洗管 道 ， 之 后将 管道 通 蒸 汽消 毒 30 min ； d) 排掉用 完的 菌种 罐剩 余菌 种，清 洗菌 种罐 。 6 贮存 玉木耳 液体 菌种 培养 好后 应立即 使用 ， 如不 能立 即 使用需 进行 贮藏 。 温度 应 低于 20 ， 但不 应低 于 10 。 发酵 罐内 液体 菌种应 持续 通入 无菌 空气 ，保持 罐压 0.01 MPa 0.03 MPa ，可 存放 2 d 。 7 记录与 档案 母种、 摇瓶液 体菌 种和发 酵罐液 体菌种 生产 的每个 环节都 要有详 实的 记录， 记录内 容按附 录 D 执 行。由 具体 操作 人员 现场 填写记 录， 定期 由主
21、管领 导审核 ，签 字后 归档 保存 ，档案 应保 存 3 年 以上 。 DB22/T 3289 2021 7 A A 附录A （资料 性） 玉木耳 菌种 培养 基配 方 A.1 母种固 体培 养基 配方 马铃薯 200 g ，葡 萄糖 20 g ，琼 脂 18 g，磷 酸二 氢 钾 1 g ，硫酸 镁 0.5 g ， 水定容 至 1000 mL ， pH 自 然。 A.2 母种液 体菌 种培 养基 配方 马铃薯 200 g ， 葡萄 糖 20 g ，蛋 白胨 3 g ，磷 酸二 氢 钾 1 g ，硫 酸镁 0.5 g ， 水 定容至 1000 mL ， pH 自 然。 A.3 发酵罐 液体
22、培养 基配 方 玉米粉 2.25 kg ，黄 豆粉 2.25 kg ， 葡萄 糖 3.75 kg ，白砂 糖 3.75 kg ， 磷酸 二氢钾 0.75 kg ，硫 酸 镁 0.375 kg ， 消泡 剂 200 mL ，水定 容至 600 L 。 DB22/T 3289 2021 8 B B 附录B （规范 性） 发酵罐 液体 菌种 检测 发酵罐 液体 菌种 检测 见表 B.1 。 表B.1 发酵罐 液体 菌种 检测 检测内 容 要 求 形态学观察 通过肉眼观察菌球形态，通过水封片观察法，使用显微镜观察菌丝体形态，用 10 倍物镜 观察菌 丝是否粗壮均匀，用 40 倍物 镜观察菌丝是否具有锁
23、状联合。发酵后期停进气后静止观察，菌球 悬浮力好， 静置基本不分层， 在菌液中分布均匀， 表面无或有少量泡沫， 菌球表面菌丝呈发散状， 说明菌种正常； 若菌球间液体浑浊， 菌球表面光滑说明菌种不正常。 形态学观察按照 NY/T 1846 执行。 霉菌检验 按 照 无 菌 操 作 从 取 样 阀 取 少 量 培 养 液 ， 接 种 于 GB/T 4789.28 中规定的 PDA 培 养 基 中 ， 置 于 28 恒温培养 48 h ，采用显 微镜和感官 观察菌 丝生长状 况 和有无杂菌 污染； 若出现白 色 以外 的杂色者，或有异味者为霉菌污染物，必要时进行镜检，霉菌检验按照 NY/T 1846
24、 执行。 细菌检验 按照无菌操作从取样阀取少量培养液， 接种于 GB/T 4789.28 中规定的营养肉汤培养液中， 置于 28 恒温培养 24 h 48 h ， 观察培养液是否浑浊。培养液浑浊，为有细菌污染；培养液澄清， 为无细菌污染。细菌检验按照 NY/T 1846 执行。 pH 测定 取样用 pH 计或 pH 试纸测定 菌液酸碱度。pH 小于 5 为不 正常。 DB22/T 3289 2021 9 C C 附录C （规范 性） 发酵罐 液体 菌种 质量 标准 发酵罐 液体 菌种 质量 标准 见表 C.1 。 表C.1 发酵罐 液体 菌种 质量 标准 检测内 容 要求 菌液色泽 玉木耳菌丝
25、球呈白色，滤液呈淡黄色，清澈透明。 菌液形态 菌液稍粘稠、不浑浊，静置基本不分层，有大量大小均一的菌丝球均匀分布。 菌液气味 无酸、臭等异味。发酵罐排气口气味正常，有玉木耳菌丝特有芳香气或无明显改变。 菌丝显微形态 大量分枝菌丝分布，有锁状联合，且菌丝内原生质分布均匀、染色剂着色深。 杂菌状态 无任何杂菌。 酸碱度pH 5.0 5.5 DB22/T 3289 2021 10 D D 附录D （资料 性） 玉木耳 液体 菌种 生产 记录 表 项 目 记录内 容 备 注 一、母种使用情况 1 生产日期/ 来源 确保菌丝有活性 2 使用数量 3 制作人 4 负责人 二、摇瓶液体菌种使用情况 1 接种日期 2 接种人 3 转速 4 温度 5 杂菌检测 6 终止培养日期 三、发酵罐液体菌种使用情况 1 发酵罐消毒灭菌情况 要求完成后签字 （1 ）发酵罐检查和空消 （2 ）培养基配制 （3 ）投料和定容 （4 ）发酵罐实消 2 接种人 3 接种日期 4 接种数量 5 杂菌检测 6 放罐接种 （1 ）接种时长 （2 ）接种温度 （3 ）接种数量 （4 ）接种人 DB22/T 3289 2021 11 表D.1 （续） 项 目 记录内 容 备 注 7 贮藏过程及杂菌发生情况 8 负责人签字 四、记录人 五、入档日期 六、档案编号 注： 每一生产批次均要进行记录。
