1、 ICS 65.020.01 CCS B 39 22 吉林省地方标准 DB 22/T 3312 2021 柞蚕蛹虫 草菌种生 产技术规 程 Code of practice for spawn production of Cordyceps militaris in Antheraea pernyi 2021 - 11 - 26 发布 2021 - 12 - 15 实施 吉林省市 场监督 管 理厅 发 布 DB 22/T 3312 2021 I 前 言 本文件按 照 GB/T 1.1 2020 标 准化工 作导则 第1部分 ： 标准 化文件 的 结构和起 草规则 的 规定起草 。 请注意本 文
2、件的 某些内 容 可能涉及 专利。 本文件 的 发布机构 不承担 识别专 利 的责任。 本文件由 吉林省 农业农 村 厅提出并 归口。 本文件起 草单位 ：吉林 省 蚕业科学 研究院 。 本文件主 要起草 人：周 影 、李森、 朱兴友 、祝长 杰 、王芹、 刘娟。 DB 22/T 3312 2021 1 柞蚕蛹虫 草菌种 生产技术 规程 1 范围 本文件确 立了柞 蚕蛹虫 草 菌种生产 的程序 ， 规定 了 生产条件 、 菌种 来源、 母 种生产、 液体菌 种 生产、 包 装、 贮 存和运 输 阶段的操 作指示 ，描述 了 生产记录 等追溯 方法。 本文件适 用于柞 蚕蛹虫 草 母种和液 体菌
3、种 （栽培 种 ）的生产 。 2 规范性 引用 文件 下列文件 中的内 容通过 文 中的规范 性引用 而构成 本 文件必不 可少的 条款。 其 中， 注日 期的引 用 文件， 仅该日 期对应 的版 本适用于 本文件； 不 注日 期的引用 文件， 其最 新版 本 （包括所有 的修改 单） 适用于本 文件。 GB/T 12728 2006 食 用 菌术语 NY/T 528 2010 食用 菌 菌种生产 技术规 程 3 术语和 定义 GB/T 12728 2006 界定 的 以及下 列 术语 和定义 适 用于本文 件。 3.1 柞蚕蛹 虫草 north cordyceps 蛹虫草菌 （Cordyce
4、ps militaris （L.ex Fr. ）Link ）寄生于柞 蚕蛹上 形成 的 子实体 与 蛹的复 合体。 3.2 母种 stock culture 经组织分 离 获得 的具有 结 实性的蛹 虫草菌 丝体纯 培 养物及其 继代培 养物。 来源：GB/T 12728 2006 ，2.5.7 ，有修 改 3.3 出草 growing fruiting body 菌丝在柞 蚕蛹体 内生长 至 表面形成 原基， 由原基 发 育成子实 体的过 程。 3.4 僵化 fossilization 柞 蚕蛹接 种蛹虫 草菌种 后 ，蛹体变 僵硬的 状态。 3.5 液体菌 种 liquid spanw 母
5、种接 种于 液体 培养 基扩 繁而来 的纯 菌丝 体栽 培种 。 3.6 菌丝转 色 mycelium change colour 在有光条 件 下， 菌丝由 白 色转为橙 黄 或橙 色。 3.7 气生菌 丝 aerial hypha 生长在培 养基表 面空间 的 菌丝。 DB 22/T 3312 2021 2 来源：GB/T 12728 2006 ，2.2.7 4 柞蚕蛹 虫草 菌种 生产 程序 的构成 柞蚕蛹虫 草菌种 的生产 程 序包括 5 个阶段 。程序 流程图如 图 1 所 示。 2 菌种 来源 （见5.2 ） 4 液体 菌种 生产 （见5.4 ） 3 母种 生产 （见5.3 ） 5
6、 包装 贮存 运输 （ 见6） 1 生产 条件 （见5.1 ） 图1 柞蚕蛹 虫草 菌种 生产 程序 5 生产技 术 5.1 生产条 件 5.1.1 场地环 境要 求 场地环境 应符合 NY/T 528 2010 中 4.2 的规定 。 5.1.2 厂房设 置 应设有原 料准备 室、 洗刷 室、 灭 菌间 、 冷却 室、 接 种室、 培养室 、 菌 种检验 室、 菌 种贮存 室和 出草试验 室等， 并合理 布 局。 5.1.3 设施设 备 设施设备 应符合 NY/T 528 2010 中 4.4 的规定 。 5.2 菌种来 源 5.2.1 应使用 种性 清楚 或者 是经 过农作 物品 种审 定
7、委 员会 登记的 蛹虫 草菌 种。 5.2.2 母种在 扩繁之 前 应 进行出 草试验 ，性状 稳定 的方可 投入生 产使用,出草 试验 设 3 次 重复 ，每 次 重复至 少接 种2 kg 优质 柞 蚕蛹 。 5.2.3 接种 柞 蚕蛹 后， 僵化 率和 出草率 应 在 70% 以 上， 培 养40 d 45 d 时 ，子 实体 长度应 在 4 cm 8 cm 之间 ， 且 直立 、整 齐 、多且 密、 橙黄 。 5.3 母种生 产 DB 22/T 3312 2021 3 5.3.1 试管扩 繁 5.3.1.1 培养基 配制 配方及配 制方法 见附录 A.1。 5.3.1.2 分装 配制好的
8、 培养基 分装至 18 mm180 mm 或 20 mm 200 mm 的玻璃试 管中 ， 分装量为 试管长 度 的四分之 一 ；试 管口保 持 干净，塞 入棉塞 ，并用 牛 皮纸包扎 。 5.3.1.3 灭菌 将 分装好 的试管 直立置 于 高压蒸汽 灭菌锅， 121 维持 30 min ， 当 温 度 降至 80 90 时，灭菌 锅放气 阀无蒸 汽 排出时， 方可开 启锅盖 ， 取出试管 。 5.3.1.4 冷却 趁热将试 管的一 端斜放 在 1 cm 厚 的木条 上摆出 斜 面， 斜面的 长度为 试管长 度的 三分 之二，斜 面顶端距 棉塞的 距离为 4 cm 5 cm ，进行 冷却、
9、凝固。 5.3.1.5 接种 无菌条件 下，用 经火焰 消 毒并冷却 后的接 种耙切取 3 mm 5 mm 3 mm 5 mm 的一块母 种迅速 转接于待 接试管 斜面培 养 基中央， 接种 后 塞好棉 塞 。 5.3.1.6 培养 在（ 222） 条件下 避 光培养 7 d 10 d ， 菌丝 长 满斜面后 见光培 养， 菌 丝 转色后保 藏于 4 冰箱中。 5.3.1.7 检验 接种后第 3 d 、第 6 d 和菌丝体长 满培养 基后逐 个进行检验 ，挑出 未活、 污染和生长 不良的 培养物， 质量应 符合表 1 的要求。 表1 试管扩 繁要求 项目 要求 检验方法 容器 完整、洁净、无破
10、损、无裂纹 肉眼观察 棉塞 干燥、洁净，松紧适中，透气 培养基灌入量 试管总容积的四分之一 测量 斜面长度 顶端距棉塞 4 cm 5 cm 菌丝生长量 长满斜面 肉眼观察 菌种正面外观 洁白、粗壮、浓密、绒毛状气生菌丝，见光后菌丝 24 h 内 变为 橙黄或橙色，均匀、无角变，无原基，表面无分泌物，无杂菌 斜面背面外观 培养基无干缩，气生菌丝与基质结合部位呈黄色，均匀，无暗斑 菌丝形态 生长 5 d 7 d ，菌丝粗壮、挺 立，无空泡，分生孢子饱满、密集 显微镜下观察 5.3.2 三角瓶 扩繁 DB 22/T 3312 2021 4 5.3.2.1 培养基 配制 配方及配 制方法 见附录 A.
11、1。 5.3.2.2 分装 将配制好 的培养 基分装 于 150 mL 无色耐 高温玻 璃 三角瓶中 ，每瓶 分装量 为 40 mL ， 瓶口保 持 干净，塞好 棉塞 ，并用 牛 皮纸包扎 ，培养 基上表 面 距 棉塞 5 cm 5.5 cm。 5.3.2.3 灭菌 分装后置 于高压 蒸汽灭 菌 锅，121 维持 30 min ， 当温 度 降至 80 90 时， 灭菌锅 放 气阀无蒸 汽排出 时，方 可 开启锅盖 ，取出 三角瓶 。 5.3.2.4 冷却 趁热摆放 于 洁净 台面上 进 行冷却 、 凝固。 5.3.2.5 接种 无菌条件 下，用 经火焰 消 毒并冷却 后的接 种耙切取 3 m
12、m5 mm 3 mm5 mm 大小的菌 块置于 培养基上 ，每管 试管扩接 40 瓶50 瓶三 角瓶。 5.3.2.6 培养 在（ 22 2） 条件下 避 光培养 8 d 11 d ， 菌丝 长满后见 光培养， 菌 丝转 色后保藏 于 4 冰 箱中。 5.3.2.7 检验 接种后第 3 d 、第 7 d 和菌丝体长 满培养 基后逐 个进行检验 ，挑出 未活、 污染和生长 不良的 培养物， 质量应 符合表 2 的要求。 表2 三角瓶 扩繁 要求 项目 要求 检验方法 容器 完整、洁净、无破损、无裂纹 肉眼观察 棉塞 干燥、洁净，松紧适中，透气 培养基灌入量 40 mL 测量 培养基上表面距棉塞的
13、距离 5 cm 5.5 cm 菌丝生长量 长满容器 肉眼观察 菌种外观 洁白、 粗壮、 浓密、 绒毛状气 生菌丝， 见光后菌丝 24 h 内变 为橙 黄或橙色，均匀、无角变，无原基，无子实体，表面无分泌物， 无杂菌 菌丝形态 生长 5 d 7 d ，菌丝粗壮、挺 立，无空泡，分生孢子饱满、密集 显微镜下观察 5.4 液体菌 种生 产 5.4.1 液体培 养基 配制 配方及配 制方法 见附录 A.2 。 DB 22/T 3312 2021 5 5.4.2 分装 将液体培养基分装至 500 mL 无色耐高温玻璃三角 瓶中，每瓶分装量为 200 mL ，并加入 20 粒25 粒 玻璃珠 ，瓶口 保持
14、干净 ，瓶塞 选用无 棉 塑料盖， 培养基 上表面 距 离瓶口 14 cm15 cm 。 5.4.3 灭菌 分装后置于 高压蒸 汽灭菌 锅 ，121 维持 30 min ，当 温度降 至 80 90 时， 灭 菌锅放 气阀无蒸 汽排出 时，方 可 开启锅盖 。 5.4.4 冷却 将液体培 养基摆 放于 洁 净 台面上 ， 待冷却 至 30 以下进行 接种。 5.4.5 接种 无菌条件 下， 用 经火焰 消 毒并冷却 后的接 种耙切取 4 块6 块大小 为 3 mm 5 mm3 mm 5 mm 的母种接 种于液 体培养 基 中，每个 三角瓶 扩接 10 瓶15 瓶 的液体 菌种。 5.4.6 培
15、养 置 于（22 2） 条件下避 光静止培 养 24 h 后，在 150 r/min 、(222 ） 条件下 ，避 光 震荡培养 96 h， 液体菌 种应随制 随用。 5.4.7 检验 每天对液 体菌种 逐个检 验 ， 挑出未萌 发、 浑浊 和生 长不良的 培养物， 液体菌 种质量应 符合表 3 的要求。 表3 液体菌 种要 求 项目 要求 检验方法 容器 完整、洁净、无破损、无裂纹 肉眼观察 无棉塑料盖 干燥、洁净，松紧适中，透气 培养基灌入量 200 mL 测量 培养基上表面距瓶口的距离 14 cm 15 cm 菌丝生长时间 96 h 记录 菌液外观 菌丝絮状或球状（0.5 mm 2 mm
16、 ）的澄清悬浊液 肉眼观察 杂菌 无杂菌 显微镜下观察 6 包装、 贮存 、运 输 6.1 包装 6.1.1 每管或 瓶均 应有 标识 ，注 明厂名 、级 别、 菌号 、生 产日期 。 6.1.2 每管或 瓶用 防震 撞的 材料 进行包 装， 注意 间隔 ，以 防破损 ，外 包装 选用 抗挤 压包装 材料 。 6.1.3 包装箱 应标 明向 上放 置、 防潮、 防冻 、防 日晒 、防 震撞的 图案 。 6.2 贮存 DB 22/T 3312 2021 6 母种在 4 10 贮 存不 超过 60 d， 液体菌 种不宜贮 存。 6.3 运输 运输不得 挤压， 碰撞， 在 4 25 条 件下运 输。
17、 7 记录与 档案 7.1 记录母 种、液 体菌 种生产 过程中 菌 种来 源、 僵化率 、出草 率、 生 产时 间、培 养条件 、数量 、技 术 负责人 、质 量检 验、 出厂 日期及 菌种 流向 等内 容。 7.2 记录应 及时 归档 ，档 案保 存期限 为 2 年 ，做 到可 追 溯。 DB 22/T 3312 2021 7 A A 附录A （规范 性） 培养基 配方 及配 制方 法 A.1 母种培 养基 配制 A.1.1 培养基 配方 马铃薯 200 g 、葡 萄糖 10 g 、蛋白 胨 10 g 、磷酸 二氢钠 2.5 g ，磷 酸二氢 钾 1.5 g 、 硫酸 镁 0.7 g、琼
18、脂 20 g 、水 1000 mL，pH 自然 。 A.1.2 配制方 法 以配制 1000 mL 培养基 为例，将 马铃薯 洗净去 皮 ，称取 200 g 切成 1 cm 1 cm 1 cm 小 块， 加蒸馏水 1000 mL，置 于 不锈钢锅 内煮沸 15 min ，用 4 层 纱布过 滤，然 后加入其 他成分 ，边加 热 边搅拌， 直到琼 脂完全 溶 解，定容 至 1000 mL 。 A.2 液体菌 种培 养基 配制 A.2.1 培养基 配方 马铃薯 200 g 、葡 萄糖 10 g 、蛋白 胨 10 g 、磷酸 二氢钠 2.5 g 、磷 酸二氢 钾 1.5 g 、 硫酸 镁 0.7 g、鲜 活 柞蚕蛹 120 g ，水 1000 mL ，pH 自然。 A.2.2 配制方 法 以配制 1000 mL 液体培 养基为例， 将马铃 薯洗净 去皮， 称取 200 g 切成 1 cm 1 cm 1 cm 小 块， 加入 1000 mL 蒸馏水 及 撕开的 鲜活柞 蚕蛹， 置 于不锈钢 锅内一 起煮沸 15 min ，4 层 纱布过 滤， 加入其他 成分， 充分溶 解 ，定容至 1000 mL。 _
