1、 DB21 辽宁省地方标 准 DB21/T 3559 2021 软枣猕猴 桃品种鉴 别 技术规 程 SSR 分子标记法 Technical regulation for the identification of Actinidia arguta SSR marker method 2021 - 12 - 30 发布 2022 - 01 - 30 实施 辽 宁 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 ICS 65.020.01 CCS B 60 DB21/T 3559 2021 I 目 次 1 范围 .1 2 规范 性引 用文 件 .1 3 术语 和定 义 .1 4 测试 准备 .2 5 DN
2、A 提取 .2 6 PCR 扩增 .3 7 PCR 扩增 产物 检测 .3 8 指纹 比对 .3 9 数据 记录 .3 10 结 果判 定 .3 附录A （资 料性 ） 仪器 设 备与主 要试 剂、 耗材 .4 附录B （资 料性 ） 溶液 配 制 .5 附录C （规 范性 ） 核心 引 物 .6 附录D （规 范性 ） 软枣 猕 猴桃 SSR 等 位基 因数 据记 录格式 .7 附录E （规 范性 ） 软枣 猕 猴桃 SSR 指 纹图 谱鉴 别报告 .8 DB21/T 3559 2021 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.1-2020 标 准化 工作导 则 第1 部 分： 标准 化文件
3、 的结 构和 起草规 则 的规 定起 草。 本文件 由辽 宁省 林业 和草 原局提 出并 归口 管理 。 本文件 起草 单位 ：辽 宁省 经济林 研究 所。 本文件 主要 起草 人： 刘振 盼、尤 文忠 、孙 阳、 周狄 、 李仁 浩、 李冬 生、 陈喜 忠、 张 雪梅 、卢立媛、 徐开源 、宋 建宇 、郝 家臣 、于雷 。 本文件 发布 实施 后， 任何 单 位和个 人如 有问 题和 意见 建议， 均可 以通 过来 电和 来 函等方 式进 行反 馈， 我们将 及时 答复 并认 真处 理，根 据实 际情 况依 法进 行评估 及复 审。 归 口 管 理 部 门 通 讯 地 址 ： 辽 宁 省 林
4、 业 和 草 原 局 （ 沈 阳 市 和 平 区 太 原 北 街2 号 ） ， 联 系 电 话 ： 024-23448927 。 文件起草单位通讯地址：辽宁省经济林研究所（大 连 市 甘 井 子 区 中 华 西 路31 号 ） ， 联 系 电 话 ： 0411-86515158 。DB21/T 3559 2021 1 软 枣猕猴 桃品种鉴 别技术 规程 SSR 分 子标记 法 1 范围 本 文件规定 了 利 用 简 单 重 复 序 列 （Simple sequence repeats ，SSR ） 分 子 标 记 法 对 软枣猕猴桃 （Actinidia arguta(Sieb.&Zucc)P
5、lanch.ex Miq. ） 材料进 行鉴 别过程 中 样品 准备 、DNA 提 取、PCR 扩增、 PCR扩 增产 物检 测、 指纹 比 对、数 据记 录、 结果 判定 等方面 的技 术要 求。 本 文件 适用 于SSR 分 子标 记 技术构 建软 枣猕 猴桃 资源DNA 指纹 图谱 过程 中DNA 分 子 数据采 集和 鉴别 。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有
6、 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB/T 19557.1 植物 新品 种 特异性 、一 致性 和稳 定性 测试指 南 总则 LY/T 2745 仁用 杏品 种鉴 定技术 规程 SSR 分 子标 记 法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。 3.1 PCR 指 聚合酶 链反 应（polymerase chain reaction ，PCR) ，是利 用一段DNA为 模板 ，在DNA 聚合酶 和核 苷酸底 物共 同参 与下 ，将 该段DNA 扩 增至 足够 数量 ， 以便进 行 检 测分 析 。 3.2 SSR 分 子标 记 SSR molecular marker
7、又称微 卫星 标记 ， 由 于每 个简单 重复 序列 两端 的序 列是高 度保 守的 单拷 贝序 列， 因 而可 根据 两 端 的 序列设 计特 异性 引物 ， 利 用PCR 技术 对两 条引 物间 的DNA重 复序 列进 行扩 增， 通 过电泳 可以 区分 不同 大小 的扩增 产物 片段 ，经 荧光 染料标 记加 以区 分。 3.3 待检样品 test sample 待鉴 别 的软 枣猕 猴桃 样品 ，由送 检人 提供 。 3.4 对照样 品 control sample DB21/T 3559 2021 2 用于与 待检 样品 进行 指纹 比对的 样品 ，由 送检 人提 供。 3.5 核心
8、引 物 core primer 扩增产 物具 有高 度的 稳定 性和一 致性 （无 干扰 谱带 ） ， 并 具有 较强 的鉴 别能 力， 可 以用 于建 立 软 枣 猕猴桃 比对 的人 工合 成引 物。 3.6 SSR 指 纹图 谱 SSR fingerprint 采用SSR 核 心引 物 （ 或相 当 于核心 引物 ） 扩 增出 的待 检 样品 和 对照 样品 的DNA 片 段 ， 通过 毛细 管电 泳， 得到不 同大 小的DNA 片段 图 谱。 3.7 指纹对 比 fingerprint comparison 将待检 样品 与对照 样品的SSR 指 纹 图谱 进 行 比对 ， 分析 待 检
9、 样品 与对照 样品的SSR 指 纹 是否 具 有差 异，并 确定 其大 小。 4 测试准 备 4.1 仪器设 备与 主要 试剂 、耗 材 仪器设 备与 主要 试剂 、耗 材参见 附录A 。 4.2 溶液配 制 溶液配 制方 法参 见附 录B 。 4.3 核心引 物 核心引 物信 息参 见附 录C 。 4.4 样品准 备 依据NY/T 2324 中样本采 集的技术规定进行样本采集 ，3次以上重复。 取无病虫害的健康的芽，做 好标记 后， 蒸馏 水清 洗后-80 保 存。 5 DNA 提取 a） 将样品 倒入 研钵 中， 加入 液氮研 磨2 次， 约取0.1 mL 放入1.5 mL 离心 管 ；
10、 b） 加入900 L 2.5 %CTAB 提 取液，65 水浴60 min，每10 min颠倒 ， 混匀 ； c） 10000 r min -1 离心1 min ， 取上清650 L ，加650 L氯仿 异 戊醇 （24:1 ） 混 合液， 混匀 ； d） 10000 r min -1 离心5 min ， 取上清400 L ，加 入800 L无 水乙 醇，-20 放置30 min ； e） 5000 r min -1 离心1 min 后倒掉上清液 ，用70 %乙醇洗3 次，自然风干 ，再用50 LTE 溶解，置 于4 备用 或保 存 ； f） 用琼脂 糖凝 胶电 泳法 检测DNA 提取 质量
11、 ，要求 电 泳条 带清晰 明亮 ； DB21/T 3559 2021 3 g） 用紫 外分光光 度 法测定 纯度和 浓度 ，OD260/OD280 比值范 围在1.71.9 之间 即为可用DNA 样品， 将其最 终质 量浓 度调 至20 ng L -1 。 6 PCR 扩增 6.1 PCR 反 应体 系 总体积 为20 L ， 其中6.0 L ddH2O ，10 L 2 Taq master mix ，2.0 L DNA 模板 （20 ng L -1 ）， 1.0 L F-primer （20 mol L -1 ，5 端 饰有FAM 荧 光标记 ），1.0 L R-primer （20 mo
12、lL -1 ）。 6.2 PCR 扩 增程 序 PCR扩增 程序 为：94 预 变 性5 min ，9430 s ，5530 s，7230 s，共35 个循 环， 最后7210 min ， 4保 存。 7 PCR 扩 增产 物检 测 7.1 标样准 备 取PCR 产物0.3 L 、LIZ500 分子 量内 标0.5 L和 去 离子甲 酰胺9.5 L混 合加 入PCR 板，95 变性5 min，4 冷 却后 离心 ，加1.0 L1 Buffer 缓 冲液 。 7.2 上机检 测 参照LY/T 2745 中毛 细管 电 泳比对 方法 。 8 指纹比 对 根据待 检样 品与 对照 样品 的谱带 位置
13、 进行 指纹 比对 ， 确定 是否 具有 差异 ； 根 据 各泳道 内分 子量 内 标 的位置 与各 样品 峰值 的位 置比较 分析 ，确 定待 测样 品和对 照样品 的 片段 大小 。 9 数据记 录 数据记 录采 用统 一格 式， 参见附 录D 。 10 结果判 定 10.1 判定方 法 将待 检 样品 与 对照 样品的SSR 指纹 比对结 果进 行分析 ，若待 检样品 与对 照 样品 有等位 基因不 同的 位 点， 则依 据该 位点 及其 等 位基因 的不 同 ， 判 定两 者 不同 ； 若 待 检 样品 与对 照 样品全 部位 点等 位基 因均 相 同，则 判定 两者 为 疑 似相 同
14、 。 10.2 判定结果 根据10.1 的 判定 结果 ，出 具鉴 别 报告 书， 参见 附录E 。 DB21/T 3559 2021 4 A A 附 录 A （资料 性） 仪器设 备与 主要 试剂 、耗 材 A.1 仪器设 备 冰箱（4 、-20 ）精 密天平 （精 度0.001 g以 上 ）、酸 度计 、2.5 L移 液 器、10 L 移液 器、 100 L移 液器、1000 L 移液器 、水 浴锅 、高压 灭 菌锅、 台式 离心 机（10000 rmin -1 或以 上） ，紫 外 分光光 度计 、磁 力搅 拌器 、PCR 扩增 仪、3730XL测序仪 、琼 脂粮 凝胶 电泳 仪， 凝胶
15、成 像系 统 。 A.2 主要试 剂 液 氮 、三 羟 甲基 氨基 甲 烷盐 酸 盐（Tris-HCl ） 、乙二 胺 四乙 酸 二钠 （EDTA-Na 2 ）、 十 六烷 基三 甲 基溴化 铵 （CTAB ） 、 氯 化 钠 （NaCl ） 、 聚 乙烯 吡咯 烷 酮 （PVP ） 、 氯仿 ： 异 戊醇 （24:1）、2Taq master mix 、引物、琼 脂糖 、去 离 子水、 无水 乙醇 、 双 蒸水 、硼酸 、B.3 TBE 电泳 缓 冲液 。 A.3 主要器 材 量筒、 玻璃 棒、 研钵 、1.5 mL 离心 管、 移液 器配 套 枪 头（2.5 L 、10 L 、100 L、
16、1000 L）、 PCR管 、96 孔板 。 DB21/T 3559 2021 5 B B 附 录 B （资料 性） 溶液配 制 B.1 DNA 提 取溶 液的 配制 B.1.1 1 mol L -1 三 羟甲 基氨 基甲 烷盐酸 盐（Tris-HCl ）溶 液（pH8.0 ） 称取30.28 gTris 于250mL 烧杯中 ， 加150 mL去 离子 水 充分搅 拌溶 解， 用1 molL -1 HCl溶 液调pH至8.0 ， 定容至250 mL， 混匀 。棕 色瓶分 装，4 冰箱 保存 。 B.1.2 0.5 mol L -1 乙二 胺四 乙酸 二钠盐 （EDTANa2 2H2O） 溶液
17、（pH8.0 ） 称取46.53 g EDTANa2 2H2O于250 mL 烧 杯中 ， 加150 mL 去离子水充分搅拌 溶解， 用1 mol L -1 NaOH 溶液调pH至8.0 ，定 容至250 mL， 混匀 。4 冰 箱保 存 。 B.1.3 DNA提 取液 依次称 取十 六烷 基三 甲基 溴化铵 （CTAB ）6.25 g、 聚乙烯 吡咯 烷酮 （PVP ）5.00 g、 氯化 钠（NaCl ） 20.454 g 至250 mL 烧 杯中 ，分别 加1 mol L -1 Tris-HCl 溶液25 mL 、0.5 mol L -1 EDTANa2 2H2O溶液10 mL ， 60
18、水 溶解 ，并 用去 离子 水定容 至250 mL ，混 匀。4 冰箱 保存 。 B.1.4 1TE 缓存 液 分别量取1 mol L -1 Tris-HCl 溶液2.5 mL 、0.5 mol L -1 EDTANa2 2H2O 溶液0.5 mL， 用 去 离 子 水 定容 至250 mL， 混匀 。4 冰 箱 保存。 B.2 引物的 稀释 合成的 引物 在高 速离 心机 中10000 rmin -1 离心2 min ，加入 去离 子水 稀释 到浓 度为20 mol L -1 。 B.3 TBE 电 泳缓 冲液 将Tris108g 、硼酸55g 、40 ml 0.5 M EDTA 溶解 在6
19、00 ml 的去 离子 水中 ，调节pH 至8.3 ，加 去离 子水 定容至1L后 ，室 温保 存。 使用时 稀释10倍即 可。 DB21/T 3559 2021 6 附 录 C （规范 性） 核心引 物 C.1 核心 引物 本文件 中PCR 反 应体 系中 规 定使用 的引 物， 用于 软枣 猕猴桃 样品 鉴别 。 表 C.1 核 心引 物 编号 引物名称 引物序列 目的片段 大小 F R 1 UDK-096 CCCAAAGTTCCTCACTCTTCC TAAACAAAAACCAAATCTGGCA 111 173 2 UDK-098 GTAAGGTTGGTACTGGCAGTCA TGCATG
20、ATTATGGTTGGCAT 75 200 3 UDK-099 TCCTATTATTGCTGACACGACA TGTTATAGGCCACCTCACTGG 65 85 4 UDK-103 TCTTCTTCCCTTTCTTGGCA GCTGTCTAGTCATTTCCCTCAA 100 167 5 UDK-104 ACATCTCGGCTGAAGATGCT AGGTTGCATATGAGTGGTTGC 135 192 6 UDK-106 CACCTGTCAAGCATTTGTAGAA GTGTTGCCAGTGAAGTTATGC 100 150 7 UDK-125 ACGAGCCCAAAATAGAGTTCA
21、 TGAGTGCAGCATAGCTACTTCC 200 269 8 UDK-128 GCTCTCGGGACTGTTTGGTA GCAACGTAAACTCCGTTAACG 119 210 9 UDK-131 CGGTGTGGAGAGGATACGAT AAGTAAAGCCATTGTCATTGCA 121 192 10 UDK-143 TGGTGTAAAGTCAAAAACAGCC AGAAGATTTCATTGTCCTCCCT 94 125 11 UDK-153 CCCCAGTGGAGATCACTTTC TGGATATCTTGCCCATCTCC 123 192 12 UDK-158 GCCCATCTA
22、ATCCGTACTCTG TCAATTGAAGCAACTCTTCTTGA 120 167 DB21/T 3559 2021 7 附 录 D （规范 性） 软枣猕 猴 桃SSR 等位 基因 数据记 录格 式 D.1 软枣 猕猴 桃SSR 等位 基因数 据记 录格 式 本文件 中用 于软 枣猕 猴桃 软枣猕 猴桃SSR 等位 基因 数 据记录 的格 式标 准。 D.1 软枣 猕猴 桃SSR 等位 基因数 据记 录格 式 引物名称 等位基因 1 大小 等位基因 2 大小 等位基因 3 大小 等位基因 4 大小 . 引物 1 引物 2 引物 3 引物 4 . DB21/T 3559 2021 8 附 录 E （规范 性） 软枣猕 猴 桃SSR 指纹 图谱 鉴 别报告 E.1 软枣 猕猴 桃SSR 指纹 图谱鉴 别报告 本文件 规定 的样 品鉴 别报 告格式 。 表E.1 软 枣猕 猴桃SSR 指 纹图谱 鉴 别 报告 送检样品编号 送检样品名称 对照样品 编号 对照样品名称 送检人 检测单位 依据标准 检测引物数量： 检测引物编号： SSR 指纹图谱检测结果： 检测差异引物和谱带： 结论： 评语： 检测单位（公章 ） 年 月 日 _
