1、ICS 65.020.20 CCS B 05 DB2301 黑龙江省哈尔滨市地方标准 DB 2301/T 93 2021 高效大豆 根瘤菌菌 株筛选技 术规程 2021 - 11 - 19 发布 2021 - 12 - 19 实施 哈 尔 滨 市 市 场 监 督 管 理 局 发布 I 前 言 本文件 依据GB/T 1.1-2020 标 准化 工作导 则 第1 部 分： 标准 化文件 的结 构和 起草规 则 的规 定起 草。 请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。 本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任 。 本文件 由中国 科 学院 东北 地理与 农业 生态 研究 所农业
2、 技术 中心 提出 。 本文件 由哈 尔滨 市农 业农 村局归 口。 本文件 起草 单位 ： 中国 科 学院东 北地 理与 农业 生态 研究所 农业 技术 中心 、 哈 尔滨市 农业 技术 推 广 总 站、黑 龙省 农业 科学 院和 东北农 业大 学。 本文件 主要 起草 人： 严君 、王崇 生 、 陆欣 春、 许艳 丽 、邹 文秀 、陈旭 、 姚玉 波 、潘 凤娟 、 居瀚寻。 1 高效大豆 根瘤菌 菌株筛选 技术规 程 1 范围 本文件 规定 了高 效大 豆根 瘤菌菌 株筛 选 技 术规 程 的 术语和 定义 、 大豆 根 瘤菌 获得、 大豆 盆栽 根瘤菌 复筛、 高效 大 豆 根瘤 菌
3、田 间验证 和档 案管 理。 本文件 适用 于 哈 尔滨 市田 间 高效 大豆 根瘤 菌菌 株筛 选 。 2 规范性 引用 文件 列文件 中的 内容 通过 文中 的规范 性引 用而 构成 本文 件必不 可少 的条 款。 其中 ，注日 期的 引用 文 件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB 3095 环境 空气 质量 标 准 GB 15618 土壤 环境 质量 农用 地土 壤污 染风 险管 控 标准（ 试行 ） GB 20287 农用 微生 物菌 剂 NY 410 根 瘤菌 肥
4、料 NY/T 1536 微 生物 肥料 田 间试验 技术 规程 及肥 效评 价 指南 NY/T 1735 根 瘤菌 生产 菌 株质量 评价 技术 规范 SN/T 2632 微 生物 菌种 常 规保藏 技术 规程 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件 。 3.1 高效大 豆根 瘤菌 存活能 力强 、具 有高 效固 氮能力 、竞 争结 瘤能 力， 接种 后 使大 豆显 著增 产的 大豆根 瘤菌 菌株 。 4 大豆根 瘤菌 获得 4.1 大豆 品 种选 择 选择当 地主 导大 豆品 种。 4.2 大豆根 瘤采 集 在 大豆 盛花 期 时 ， 选 取叶 色浓绿 、 生 长旺 盛的 大
5、豆 植株， 将大 豆根 系挖 出 带 回实验 室， 用清 水冲干 净后， 选取 4 至 6 个 新鲜 的颗粒 饱满 、深 红色 的大 根瘤（ 带部 分根 ）从 根部 分离 。 4.3 大豆根 瘤菌 菌株 分离 与纯 化 2 将采集的根瘤用 0.1 % 升汞溶液表面灭菌 3 min，无菌水冲洗 8 次 10 次。在无菌 条件下，用镊子将 根瘤压 碎， 挤出 汁液 涂布 在 根瘤 菌琼 脂 培 养基 上， 2 6 28 暗培养 ， 快生 菌 培养 3 d 4 d， 慢生 菌培 养 5 d 7 d，将 长出 的单 菌 落 采用划 线培 养法 分离 。根 瘤菌琼 脂培 养基 配方 应符 合 NY 41
6、0 中的 规定 。 4.4 大豆根 瘤菌 菌株 确定 肉眼观 察菌 落一 致 、 无 杂 菌后再 纯化 1 次 2 次 ， 即 获得纯 菌株 。 根据 获得 菌 株的菌 体和 菌落 特征 ， 可初步 确定为 大豆 根瘤菌 ，菌体 和菌落 特征 应符合 NY 410 中的 规定。 将纯 菌 株在无 菌条件 下接 种于 根 瘤菌液体 培养基 中， 在 180 r min-1 和 28 的恒温 摇床中培 养至对 数生 长期 ，并将供 试菌株 的菌 液 在 600 nm 的 OD 值 均调 至 0.8 时作 为接 种菌 液。 大豆接种验证：选择 当地主导大豆品种。 大豆种子表面消毒后催芽，种芽长 1
7、mm 2 mm 时用纯菌 株 接 种液浸泡 1 min 2 min ，然 后移植到 试管 根瘤 菌 琼脂 斜面上 。 设不接种 的 阴性 对照和接 种已知菌 的阳 性对照 ，每 个处 理重 复 3 次， 在 20 25 下 培养 ，光强 7 000 lx 8 000 lx ， 每天光 照时 间 12 h 13 h。 10 d20 d后 观察 大豆 结瘤 情况。 如不接 种的 阴性 对 照结瘤 ， 试验 需要 重做。 空白对 照不 结瘤， 可 以 判 定 试验没 有污 染 ， 在 10 -5 稀 释度中 70 % 植株 结有 效瘤 ， 用 刀片 将根 瘤切 开 ， 若 根瘤内 部为 粉红 色 、
8、 红 色 或 褐色为 有效 根瘤 ，白 色或 绿色为 无效 根瘤 ，即 确定 接种菌 为大 豆根 瘤菌 菌株 。 4.5 大豆根 瘤菌 菌株 保存 大 豆根 瘤菌 菌株 保存 ，应 该符合 SN/T 2632 中 的规 定。 5 大豆 盆 栽根 瘤菌 复筛 5.1 试验准 备 蛭石 采用间歇性高压湿热灭菌 2 次，每次 121 1 h ，然后置于阴凉通风处 2 d 3 d。盆钵用 5 % 次氯 酸钠或 0.1 % 高锰酸钾溶液 消毒，并用无菌水 冲洗， 将灭菌蛭石装入盆 钵中， 浇适量无菌水备用 。选择 当地主导大豆 品种 。将 4.2 中确定的大豆根 瘤菌菌株 ，制备成菌体 数量 1.0 1
9、0 -9 cfu/mL 的 接种液 ， 接种液 制备 应执 行 NY/T 1735 的 规定 。 5.2 盆栽 实 施和 管理 选择 当 地主 导大 豆品 种 。 设置空 白接 种 ： 将 已表 面 灭菌的 大豆 种子 播于 灭菌 后蛭石 中 。 大 豆接 种验 证（ 待 测根 瘤菌 接种 ） ： 将 已表面 灭菌 的大 豆种 子在 待测根 瘤菌 接种 液中 浸泡 1 min 2 min ， 移 植到 灭 菌 后的蛭 石中 。 然 后在 20 25 下培 养， 光 强 7 000 lx 8 000 lx ， 每 天光 照时 间 12 h 13 h 。 每 盆定植 1 株 2 株 大豆 ，不 施
10、肥 或只 施 无氮营 养液 。 5.3 大豆根 瘤菌 与大 豆品 种的 共生匹 配性 和固 氮能 力检 测 在大豆 初花 期 ， 将 植株 连 根取出 后用 清水 洗净 ， 观 察根系 结瘤 情况 和根 瘤菌 的有效 性 。 不 接种 处理 应不结 瘤， 若结 瘤须 重新 进行盆 栽实 验。 植株 样品 在 105 下 杀青 5 min 10 min ， 再 在 80 下烘 至恒 重， 测定每 盆植 株干 重和 含氮 量， 并 计算 植株 总含 氮量 和 待测接 种菌 株处 理较 不接 种处 理 植株 总氮 量的 增 加 量。植 株含 氮量 测定 及其 增加量 的计 算应 执行 NY/T 17
11、35 中的 规定 。接 种待测 菌株处 理与 不接 种处 理 相 比，收 获大 豆植 株总 氮量 增加 20 % ，统 计检 验达 到显著 水平 ，确 定该 待测 菌为高 效大 豆根 瘤菌 。 6 高效大 豆根 瘤菌 田间 验证 3 6.1 试验设 计 试验处 理： 不接 种根 瘤菌 、 接 种参比 菌株 、 接 种待 测根瘤 菌菌 株。 小区 面积 30 m 2 ， 每 个处 理 3 个重复 ，小 区采 用长 方形 ，种植 在 2 个 不同 土壤 肥力地 区， 随机 排列 ，试 验设计 应符 合 NY/T 1536 的 规定。 6.2 试验准 备 6.2.1 试验地 准备 试验地 选择 应具
12、 有代 表性 ， 地势 平坦 ， 土 壤肥 力均 匀， 前 茬作 物一 致， 浇排 水条件 良好 ， 土 壤 肥 力 应为中 低水 平。 试验 田应 避开道 路、 堆肥 场所、 水 沟、 水 塘、 高 大建 筑物 及 树木遮 阴等 特殊 地块 ， 应符 合 NY/T 1536 的规 定。 土壤 环境 质 量应 符合 GB 15618 规定， 空气 环境 质量 应符 合 GB 3095 的 规定 。整地、 设置保 护行、 试验 地区划 （小区 、重复 间尽 量保持 一致） ； 小区 单灌单 排； 测 定土壤 的有机 质、 全氮 、 速效磷 、速 效钾 、pH 等基 本理化 性质 。 6.2.2
13、根瘤菌 菌株 接种 液准 备 按照试 验设 计准 备所 需要 的根瘤 菌接 种液 ，菌 液质 量 应符 合 GB 20287 中的 规 定。 6.2.3 大豆品 种准 备 选择当 地主 导大 豆品 种。 6.3 田间试 验实 施和 管理 6.3.1 施肥措 施 按照常 规施 磷肥 和钾 肥。 根据土 壤的 含氮 量可 适当 施用少 量氮 肥。 6.3.2 田间管 理 符合 NY/T 1536 的规 定。 6.4 测产及 评价 大豆收 获期 ， 每 个 小 区单 打、 单 收、 单计 产或 取代 表样方 测产 。 计 算 接 种待 测根瘤 菌菌 株处 理 与 不 接种处 理产 量相 比 ， 籽 粒 产量增 加 10 % ， 统计 检 验达到 显著 水平 ； 接种 待 测根瘤 菌菌 株处 理与 接种 参 比菌株 处理 相比 ， 籽粒 产 量增加 5 % ， 统 计检 验达 到显著 水平 ， 即可 确定 该 待测菌 为高 效大 豆根 瘤菌 。 高效大 豆根 瘤菌 的评 价要 求应符 合 NY/T 1735 中的 规定。 7 档案管 理 建立档 案， 内容 包括 ：大豆 根瘤 菌获 得、 盆栽 根瘤 菌复筛 、高 效大 豆根 瘤菌 田间验 证 （ 试验 设 计 、 试验准 备、 田间 试验 实施 和管理 、测 产及 评价 ）。
